人用流脑-肺炎球菌联合疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种基于重组ΔfHbp‑NadA融合蛋白载体的人用流脑‑肺炎球菌联合疫苗及其制备方法。通过设计软性连接肽链将两个活性蛋白融合表达，再保持各自的活性的同时让两者成为单一的蛋白质，因而在工业生产及免疫接种是更具有可控性，风险大大降低，又能提供更多的多糖‑蛋白结合位点以实现一次给药多重免疫的效果。

Human meningococcal pneumococcal vaccine and its preparation method

The invention provides a human pneumococcal conjugate vaccine based on recombinant Delta fHbp NadA fusion protein carrier and a preparation method thereof. Through the design of a soft peptide chain, the two active proteins are fused, then their activity is maintained and the two become a single protein. Therefore, the industrial production and immunization are more controllable, the risk is greatly reduced, and more polysaccharide protein junction sites can be provided to achieve multiple immunization. The effect.

【技术实现步骤摘要】
人用流脑-肺炎球菌联合疫苗及其制备方法
本专利技术属于生物
，特别是涉及一种人用流脑-肺炎球菌联合疫苗及其制备方法。
技术介绍
一、病原微生物与疫苗能引起人体或动物体发生传染病的微生物，称为病原微生物或致病微生物。传染是指病原微生物侵入机体后，在一定的部位生长、繁殖，并引起一系列病理生理的过程。当病原微生物侵入机体后，病原微生物与机体互相作用，互相改变对方的活性与功能，因此能否引起传染病，一方面取决于病原微生物的致病能力即致病性或毒力，另方面还取决于机体的抵抗力即免疫力。病原性细菌引起传染的能力大小，就是细菌的毒力或致病性。细菌毒力的有无和毒力的强弱主要取决于它的侵袭力、产毒素性和引起超敏反应的能力。细菌产生的毒素可分为外毒素和内毒素两大类。外毒素是病原菌在生长繁殖期间分泌到周围环境种的一种代谢产物，主要由革兰氏阳性菌产生，少数革兰氏阴性菌也能产生。其化学组成是蛋白质，抗原性强，毒性也强，但极不稳定，对热和某些化学物质敏感，容易受到破坏。常见的如：白喉棒杆菌产生的白喉外毒素、破伤风梭菌产生的破伤风毒素、霍乱弧菌产生的肠毒素、肉毒梭菌产生的肉毒毒素等。大多数革兰氏阴性细菌能产生内毒素，实际上它存在于细菌细胞壁的外层，属于细胞壁的组成部分，一般情况下并不分泌到环境中，只有当细菌溶解后才释放出来，因而称为内毒素，其毒性比外毒素要低，抗原性也弱。同种生物的不同个体，当它们与病原菌接触后，有的患病，有的则安然无恙，原因在于不同个体的免疫力不同。免疫就是指机体识别和排除抗原异物(如病原微生物等)的一种保护性反应。一般来讲，它对机体是有利的，在异常条件下，也可能损害机体。人体的免疫分为非特异性免疫和特异性免疫。其中特异性免疫是指机体针对某一种或某一类微生物或产物所产生的特异抵抗力。而疫苗即是科学家研制出来使机体产生特异性免疫抵抗病原微生物对人体侵害的生物制品，通常由病原微生物本身加以制备而成的。细菌、病毒和立克次氏体等病原微生物制成疫苗，注射机体后，使机体产生特异性或致敏性淋巴细胞，分泌抗体，达到特异性免疫效果。而疫苗又分为治疗性和预防性两种，通过治疗性疫苗治疗疾病，并通过预防性疫苗保护人体不受致病性微生物的侵害。经过多年的努力，医学界已经开发出各种不同的疫苗用以预防，诸如细菌、病毒和真菌等，感染造成的各种疾病，极大地提高了人类的健康水平。生物技术的不断发展，促进了疫苗品种的多样化。用以预防病毒导致的传染病有灭活病毒技术开发出来的疫苗，如乙脑疫苗、脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗等；减毒病毒技术开发出来的减毒活疫苗，如轮状病毒疫苗、口服脊髓灰质炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗、风疹病毒疫苗和水痘疫苗等。用以预防细菌性传染病的有用蛋白和多糖等生物大分子纯化技术开发出来的细菌类疫苗，如破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素及其亚细胞组分、流行性脑膜炎球菌多糖和23价肺炎球菌多糖等。更先进的有用半化学结合技术开发出来的预防脑膜炎和肺炎的细菌疫苗，如流行性嗜血杆菌b型多糖-蛋白缀合疫苗、7价或10价肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗以及4价脑膜炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗。通过对生物技术的不断改进，能够开发出更多的新型疫苗产品来应付不同的病原微生物对人类健康的挑战。二、多糖-蛋白缀合疫苗及其蛋白载体多糖是病原菌中的一种重要免疫有效成分，有菌体多糖(OPS)和荚膜多糖(CPS)之分。当病原体侵入机体后，它们作为免疫原，能刺激机体产生保护性免疫应答。而目前许多能引起危害严重的疾病的病原体如流感嗜血杆菌b型(HaemophilusinfluenzaetypeB，Hib)，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae，Spn)和脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis，Nm)其表面都具有多糖，这些多糖能够赋予病原体对补体介导的杀伤和吞噬作用产生抗性，从而促进它们发病期间在血液中的存活。第一代针对Hib，Spn和Nm的疫苗即以多糖为抗原。但不幸的是，这些多糖疫苗在幼儿中不是免疫原性的，并且不能产生免疫记忆。这是因为多糖分子属于T细胞不依赖性抗原(Ti-Ag)，免疫原性较弱，接种婴幼儿后免疫效果尤其不理想。为了提高多糖疫苗的免疫原性，在20世纪20年代和30年代由Landsteiner，Avery和Goebel通过与蛋白质偶联来增强。1980年，JohnRobbins和RachelSchneerson描述了Hib多糖与白喉和破伤风类毒素蛋白的缀合物，极大的增强了动物模型中的抗体反应。最终Hib多糖-蛋白质缀合物，在人类婴儿中引发记忆型抗体应答。新一代的多糖-蛋白质缀合疫苗，在疫苗学中创造了复兴。这类缀合物将过去的T细胞非依赖性多糖疫苗转化为在儿童中具有更强免疫原性的T细胞依赖性疫苗，显示具有产生具有高亲合力的抗体的能力，建立免疫记忆，并产生群免疫效应。此外，它们改善了年轻婴儿的未成熟免疫系统和老年人的衰老免疫系统的保护性应答，从而达到最佳的免疫效果。迄今为止，5种载体蛋白已用于许可上市的缀合疫苗中：白喉毒素无毒变异体(CRM197)，破伤风类毒素(TT)，脑膜炎球菌外膜蛋白复合物(OMP)，白喉类毒素(DT)和流感嗜血杆菌蛋白D(HiD)。临床试验已经证明这些缀合疫苗在预防感染性疾病和改变Hib，Spn和Nm的药物中的功效。所有5种载体蛋白质在增加疫苗免疫原性方面都是有效的，但是它们引起的抗体的量和亲合力不同，在同一产品中携带多种多糖的能力以及与其它疫苗同时作用的能力也不同。CRM197是从白喉棒杆菌C7(β197)培养物中分离的白喉毒素的无毒变体。CRM197与野生型白喉毒素的不同之处在于，在氨基酸位置52处的点突变用谷氨酸代替甘氨酸，这消除了其酶活性和毒性。CRM197与白喉毒素在抗原上是不可区分的，但是具有作为缀合蛋白的优点：无毒的，并且具有更多的赖氨酰侧链可用于缀合。用作缀合物的CRM的另一种形式是纯化的天然白喉毒素，其随后用甲醛解毒，称为白喉类毒素(DT)，不应与CRM197混淆。TT是破伤风梭菌培养物产生的破伤风毒素用甲醛解毒来制备得来。OMP为Nm菌血清型B群外膜蛋白复合物。DT是白喉杆菌培养物产生的白喉毒素，通过甲醛解毒制备得来。HiD是最初用超声处理流感嗜血杆菌中，通过SDS-PAGE步骤纯化分离流感嗜血杆菌表面蛋白，但是目前的疫苗都是通过基因工程获得重组蛋白。TT、DT等类毒素早已工业化生产，较易获得，而且与多糖偶联后确实可大大增强多糖的免疫原性。但为获得类毒素，需对细菌毒素进行化学脱毒。而在这一过程中会产生点对点突变或不必要的修饰，致毒素的理化性质改变，破坏了重要的T细胞抗原表位，影响其免疫原性。如采用无毒的变异毒素CRM197就可避免上述问题。然而体内存在的类毒素抗体(TT和DT已大量使用)可能会导致超敏反应或引起抑制抗糖反应(免疫抑制)等问题。采用相同种属细菌的多糖与载体蛋白就可避免这些潜在问题。例如开发Nm疫苗，以B群的蛋白或OMP蛋白为载体制备A、C、Y、W135群多糖-蛋白缀合疫苗不失为一个良好策略，理论上其可预防几乎所有致病性Nm，但前提是该B群蛋白载体是“广谱”的或是具有很大交叉反应性的。因此，开发新型的，能够赋予疫苗以真正的保护性免疫原性的蛋白载体迫在眉睫。三本文档来自技高网...

【技术保护点】
人用流脑‑肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：以一重组ΔfHbp‑NadA融合蛋白为载体蛋白，其中：肺炎球菌荚膜多糖与脑膜炎球菌荚膜多糖分别独立地与所述载体蛋白连接；所述载体蛋白包括重组ΔfHbp、柔性连接肽段和NadA，所述重组ΔfHbp包含fHbp可变体V1的VA、VB结构域以及fHbp可变体V3的VC、VD、VE结构域；所述脑膜炎球菌荚膜多糖不包括B群。

【技术特征摘要】
2017.03.22 CN 20171017500281.人用流脑-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：以一重组ΔfHbp-NadA融合蛋白为载体蛋白，其中：肺炎球菌荚膜多糖与脑膜炎球菌荚膜多糖分别独立地与所述载体蛋白连接；所述载体蛋白包括重组ΔfHbp、柔性连接肽段和NadA，所述重组ΔfHbp包含fHbp可变体V1的VA、VB结构域以及fHbp可变体V3的VC、VD、VE结构域；所述脑膜炎球菌荚膜多糖不包括B群。2.如权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于：所述重组ΔfHbp的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：1所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQIDNO：2所示。3.如权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于：所述柔性连接肽段的核苷酸编码序列如序列表SEQIDNO：3所示。4.如权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于：所述重组ΔfHbp-NadA融合蛋白载体的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：4所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQIDNO：5所示。5.如权利要求1所示的联合疫苗，其特征在于：所述脑膜炎球菌荚膜多糖选自A群、C群、Y群和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖的一种或以上组合。6.如权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于：所述肺炎球菌荚膜多糖为分离提纯血清型肺炎球菌荚膜上的荚...

【专利技术属性】
技术研发人员：史晋，刘昊智，艾智武，李津，吴克，
申请(专利权)人：武汉博沃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42