用于基因组编辑的CRISPR/CAS9复合物制造技术

本文提供了CRISPR/Cas9复合物及其使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因组编辑的CRISPR/CAS9复合物本申请要求2015年6月17日提交的美国临时申请No.62/181,138和2015年12月11日提交的美国临时申请No.62/266,316的权益，这两件申请据此以引用的方式全文并入本文中。背景成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-相关联的(Cas)体系(CRISPR-Cas9体系)用于哺乳动物细胞中所需基因组位点处的基因编辑。在CRISPR-Cas9体系中，Cas9核酸酶通过与指导RNA复合而靶向至基因组位点，所述指导RNA与基因组中的靶位点杂交。这导致经由双链或单链DNA修复模板而引发基因组DNA的非同源性末端接合(NHEJ)或同源引导的修复(HDR)的双链断裂。然而，经由HDR修复基因组位点效率不高。概述本文提供了一种用于校正细胞或细胞群的基因组中的突变的复合物。所述复合物包含指导RNA(gRNA)，该指导RNA包含：第一核苷酸序列，其与细胞基因组中的靶DNA杂交，其中所述靶DNA包含突变；以及第二核苷酸序列，其与定点核酸酶相互作用。所述复合物还包含可操作地连接至超荷电蛋白的重组定点核酸酶，其中所述定点核酸酶包含与指导RNA的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于校正细胞基因组中的突变的复合物，其包含：a.指导RNA(gRNA)，所述指导RNA包含：第一核苷酸序列，其与所述细胞基因组中的靶DNA杂交，其中所述靶DNA包含突变；以及第二核苷酸序列，其与定点核酸酶相互作用；b.重组定点核酸酶，其可操作地连接至超荷电蛋白，其中所述定点核酸酶包含与所述指导RNA的所述第二核苷酸序列相互作用的RNA结合部分，并且其中所述定点核酸酶特异性结合并且切割所述靶DNA以产生双链断裂；以及c.单链供体寡核苷酸(ssODN)，其与所述靶DNA中所述双链断裂侧翼的基因组序列杂交并且整合到所述靶DNA中以校正所述靶DNA中的突变。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.17 US 62/181,138;2015.12.11 US 62/266,3161.一种用于校正细胞基因组中的突变的复合物，其包含：a.指导RNA(gRNA)，所述指导RNA包含：第一核苷酸序列，其与所述细胞基因组中的靶DNA杂交，其中所述靶DNA包含突变；以及第二核苷酸序列，其与定点核酸酶相互作用；b.重组定点核酸酶，其可操作地连接至超荷电蛋白，其中所述定点核酸酶包含与所述指导RNA的所述第二核苷酸序列相互作用的RNA结合部分，并且其中所述定点核酸酶特异性结合并且切割所述靶DNA以产生双链断裂；以及c.单链供体寡核苷酸(ssODN)，其与所述靶DNA中所述双链断裂侧翼的基因组序列杂交并且整合到所述靶DNA中以校正所述靶DNA中的突变。2.根据权利要求1所述的复合物，其中所述超荷电蛋白可操作地连接至所述核酸酶的氨基末端或羧基末端。3.根据权利要求1或2中任一项所述的复合物，其中所述复合物还包含可操作地连接至所述定点核酸酶的所述氨基末端的反式作用转录活化因子(TAT)肽。4.根据权利要求1-3中任一项所述的复合物，其中所述复合物还包含可操作地连接至所述定点核酸酶的所述羧基末端的反式作用转录活化因子(TAT)肽。5.根据权利要求1-4中任一项所述的复合物，其中所述复合物还包含长度为约10至约25个氨基酸的带负电荷的肽，所述肽可操作地连接至所述定点核酸酶的所述羧基末端。6.根据权利要求5所述的复合物，其中带负电荷的肽为包含SEQIDNO：50的INF7肽。7.根据权利要求1-6中任一项所述的复合物，其中所述超荷电蛋白具有比其对应的未修饰蛋白更大的总正电荷。8.根据权利要求7所述的复合物，其中所述总正电荷为约+5至约+40。9.根据权利要求8所述的复合物，其中所述超荷电蛋白为超荷正电绿色荧光蛋白(GFP)。10.根据权利要求9所述的复合物，其中所述超荷电蛋白为超荷正电的+36GFP。11.根据权利要求1-10中任一项所述的复合物，其中与所述靶DNA中所述双链断裂侧翼的所述基因组序列杂交的所述ssODN是用于所述靶DNA中的突变的同源引导的修复的模板。12.根据权利要求11所述的复合物，其中所述ssODN与编码血红蛋白的基因组序列杂交。13.根据权利要求1-12中任一项所述的复合物，其中所述核酸酶为Cas9。14.根据权利要求1-13中任一项所述的复合物，其中gRNA、可操作地连接至超荷电蛋白的定点核酸酶以及ssODN的摩尔比为约1∶1∶0.2至约1.5∶1∶2.0。15.根据权利要求1-14中任一项所述的复合物，其中gRNA、可操作地连接至超荷电蛋白的定点核酸酶以及ssODN的摩尔比为约1∶1∶1至约1.5∶1∶1∶15。16.一种细胞，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的复合物。17.根据权利要求16所述的细胞，其中所述细胞为真核细胞。18.根据权利要求17所述的细胞，其中所述真核细胞为人细胞。19.根据权利要求16-18中任一项所述的细胞，其中所述细胞为生殖细胞、干细胞或前体细胞。20.根据权利要求19所述的细胞，其中所述干细胞为诱导性多能干细胞。21.根据权利要求19所述的细胞，其中所述前体细胞为造血干细胞。22.根据权利要求16-21中任一项所述的细胞，其中所述细胞为体外的、离体的或体内的。23.一种对细胞群中的靶DNA进行位点特异性修饰的方法，其包括向所述细胞中引入根据权利要求1-15中任一项所述的复合物，其中在允许同源引导的修复(HDR)和所述ssODN向所述靶DNA中整合的条件下将所述复合物引入所述细胞中。24.根据权利要求23所述的方法，其中通过核穿孔将所述复合物引入所述细胞中。25.根据权利要求23或24所述的方法，其中整合到所述靶DNA中的所述ssODN校正所述靶DNA中的突变。26.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述细胞群中的同源引导的修复与非同源性末端接合(NHEJ)的比率为约10至约0.5。27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述突变在至少5％的所述细胞中被校正。28.根据权利要求27所述的方法，其中经校正的细胞的所述细胞存活率为至少约50％。29.根据权利要求23-28中任一项所述的方法，其中gRNA、可操作地连接至超荷电蛋白的定点核酸酶以及ssODN的摩尔比为约1∶1∶0.2至约1.5∶1∶2.0。30.根据权利要求23-29中任一项所述的方法，其中所述靶DNA编码血红蛋白。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述位点特异性修饰校正与镰状细胞性贫血相关联的血红蛋白突变。32.根据权利要求30所述的方法，其中所述位点特异性修饰校正与β-地中海贫血相关联的突变。33.一种治疗受试者的与编码血红蛋白的基因组序列中的突变相关联的疾病的方法，其包括：a.在允许同源引导的修复(HDR)的条件下将根据权利要求11所述的复合物引入从所述受试者获得的细胞群中，以校正编码血红蛋白的所述基因组序列中的所述突变，以及b.将步骤(a)的所述细胞移移植到所述受试者中。34.根据权利要求33所述的方法，其中与编码血红蛋白的所述基因组序列中的突变相关联的疾病为镰状细胞病或β-地中海贫血。35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述细胞为造血干细胞或诱导性多能干细胞。36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中至少5％的所述移植细胞包含经校正的突变。37.根据权利要求33-36中任一项所述的方法，其中所述细胞群中的同源引导的修复与非同源性末端接合的比率为至少约0.5。38.根据权利要求33-36中任一项所述的方法，其中通过核穿孔将所述复合物引入所述细胞中。39.一种校正与T细胞病症相关联的突变的方法，其包括：将复合物引入从患有所述T细胞病症的受试者获得的细胞群中，所述复合物包含：a.指导RNA(gRNA)，所述指导RNA包含：第一核苷酸序列，其与所述细胞基因组中的靶DNA杂交，其中所述靶DNA包含与所述T细胞病症相关联的所述突变；以及第二核苷酸序列，其与定点核酸酶相互作用；b.重组定点核酸酶，其可操作地连接至超荷电蛋白，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒂姆·汤斯，丁磊，詹家伟，
申请(专利权)人：UAB研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国,US