一种即用型多探针杂交玻片及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于荧光原位杂交技术领域，具体涉及一种即用型多探针杂交玻片及其制备方法和应用。所述多探针杂交玻片由探针附着玻片、各探针、杂交缓冲液和样本附着玻片组成；各探针以冻干的形式分别附着在各相互独立的探针附着区上；样品滴加在样品附着区上，当样本附着区与探针附着区贴合时，样品附着区的样品与相对应的探针附着区的探针实现杂交结合。相比于传统的FISH实验，本发明专利技术可以再一张玻片上同时预置多组探针，并且可以再同一张玻片上完成多种探针的检测，大大简化了传统FISH的操作步骤；减少了探针的使用量降低了探针的使用成本；本发明专利技术所述的即用型多探针杂交玻片具有极高的信噪比、特异性以及样本检出率。

A kind of use type multi probe hybrid glass slide and its preparation and Application

The invention belongs to the field of fluorescence in situ hybridization technology, in particular to a kind of use type multi probe hybrid glass slide and its preparation method and application. The hybridization probe attached by the slide slide, each probe, hybridization buffer and sample attached glass composition; each probe in a lyophilized form are attached to each independent probe attachment region; sample dropping in the sample attachment region, when the sample attachment region and probe attached region joint, sample the sample is attached to the probe and probe corresponding to the attachment region to achieve hybridization. Compared to the traditional FISH experiment, the invention can again slide simultaneously preset set of probes, and can be the same slides on the complete detection of multiple probes, greatly simplifies the operation steps of the traditional FISH; to reduce the amount of probe reduces the cost of using a probe; the signal-to-noise of the invention is using multi probe hybridization slide with high ratio, specificity and sample detection rate.

【技术实现步骤摘要】
一种即用型多探针杂交玻片及其制备方法和应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种即用型多探针杂交玻片及其制备方法和应用。
技术介绍
荧光原位杂交是一种在20世纪80年代放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性分子遗传技术，以荧光素标记取代放射性同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。FISH具有安全、快速、灵敏度高及同时显示多种颜色等优点。目前在血液学FISH的检测中，通常使用的都是常规载玻片，并且探针和载玻片是分开单独使用的，通常需要先使用血液样本制片，再将玻片进行一系列前处理，再滴加探针并使用橡皮胶封片，封片后再进行探针样本共変性以及杂交；目前常见的血液病如白血病的FISH检测项目多达数几十种，例如CLL(慢性粒细胞白血病)需要检测cMYC基因断裂、P16缺失、E2A断裂、超二倍体检测(CEP10/CEP17/CEP4)、TEL/AML1融合、MLL断裂、BCR/ABL融合以及IGH断裂等来评估疾病类型及进程。如果以现有杂交技术在针对需要检测多种探针的疾病时需要重复进行多次检测，费时费力。此外传统的FISH实验使用的是传统FISH探针需要过夜杂交并且一次性检测多个项目不仅耗时，而且高昂的费用也增加了患者的经济负担。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，目的在于提供一种即用型多探针杂交玻片及其制备方法和应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种即用型多探针杂交玻片试剂盒，由探针附着玻片、各探针、杂交缓冲液和样本附着玻片组成；所述探针附着玻片上包含若干个相互独立的探针附着区，各探针以冻干的形式分别附着在各相互独立的探针附着区上；所述样品附着玻片上包含若干个相互独立的样品附着区，样品附着区与探针附着区一一对应，样品滴加在样品附着区上，当样本附着区与探针附着区贴合时，样品附着区的样品与相对应的探针附着区的探针实现杂交结合。上述方案中，所述探针附着玻片由探针信息标识区、探针附着区域和杂交玻片接合区组成，所述探针信息标识区上记录了每个独立的探针附着区上对应的探针种类，所述探针附着区域内包含若干个相互独立的探针附着区，探针以冻干的形式附着在探针附着区上，所述杂交玻片接合区的表面附有丙烯酸脂胶水，用于探针附着玻片的包装封膜以及和样本附着玻片的粘结。上述方案中，所述探针附着区域为一凹槽，凹槽内含若干个相互独立的探针附着小区块，每个独立的探针附着小区块由探针附着区和外围隔离区组成；每个独立的探针附着小区块之间存在隔离小沟。上述方案中，所述样本附着玻片由样品信息记录区、样品附着区和样品隔离区组成，所述样品信息记录区上记录了样本信息，样品滴加在样品附着区上，所述样品隔离区用于防止样品交叉污染。上述方案中，所述样品附着区采用亲水材质；所述样品隔离区附有疏水涂层。上述方案中，所述杂交缓冲液的组分为：10wt％碳酸亚乙酯、30wt％硫酸葡聚糖、1ugRNaseA、0.6M氯化钠、10mM柠檬酸缓冲液。上述方案中，所述探针为FISH基因位点探针或FISH基因着丝粒/端粒探针。上述方案中，各探针选自如下组合A或组合B：组合A：BCR/ABL，IGH/BCL2，AML/ETO；组合B：PML/RARA，BCR/ABL，P53，D13S319，1Q21，IGH/BCL2，CBFB，AML/ETO。上述即用型多探针杂交玻片的制备方法，包括如下步骤：(1)制备附着有各探针的探针附着玻片：a.制备具有上述结构的探针附着玻片；b.使用去离子水配制赋形剂，所述赋形剂的配方为：左旋糖苷0.5wt％、阿拉伯胶树3wt％、甘露醇1wt％、聚丙烯酸酯0.3wt％；c.分别配制各探针溶液，将各探针溶液分别与赋形剂混合均匀，分别滴加并均匀涂抹在探针附着玻片上每个独立的探针附着区上；然后将探针附着玻片冻干、封膜，制备得到附着有各探针的探针附着玻片；(2)制备具有上述结构的样本附着玻片；(3)配制杂交缓冲液；(4)由制备所得附着有探针的探针附着玻片、杂交缓冲液和样本附着玻片组成即用型多探针杂交玻片。上述即用型多探针杂交玻片的应用，具体包括如下步骤：(1)样本处理：将固定好的外周血细胞分别滴加到样本附着玻片的样品附着区，将样本附着玻片浸入盛有37℃2XSSC的容器中老化30min，微波炉高火加热处理3min直至液体沸腾，然后再中低火继续加热处理10min；处理完成后立即将玻片置于-20冰箱摄氏度预冷的梯度酒精中脱水晾干，备用；(2)探针样本共変性：分别向探针附着玻片上探针附着区滴加杂交缓冲液，并将样本附着玻片倒扣，使样本附着区与探针附着区贴合在一起，贴合后将整个杂交玻片与样本附着玻片一起反转，置于金属浴73℃变性5min，变形完成后将杂交装置置于37℃湿盒杂交1h；(3)杂交后洗涤：待杂交完成后移去探针附着玻片，将样本附着玻片置于60℃预热的洗液(含0.3M氯化钠、0.03M柠檬酸钠和0.1％Tween-20)中洗涤去除未结合探针；洗涤完成后将玻片置于室温蒸馏水中再次洗涤，并室温晾干；(4)复染及镜检：向晾干的样本附着玻片的样品附着区滴加抗淬灭封片剂，使用盖破片封片并在荧光显微镜下观察杂交结果。本专利技术中所述FISH基因位点探针的制备方法如下：(1)从UCSCGenomeBrowser下载探针所覆盖区域的基因组非重复序列，将获得的探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的探针序列；(2)使用DNA合成仪对步骤(1)所得带有标签序列的探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到探针库；分别合成5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物和5’端带有荧光基团的M13通用引物，使用5’端带有荧光基团的M13通用引物对探针库进行扩增标记反应；(3)步骤(2)所得探针库的扩增标记产物经纯化、稀释后得到荧光标记的探针库。上述方案中，步骤(1)中所述探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85～99℃，GC比40～80％，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针间最小间隔5bp；步骤(1)所述标签序列的碱基序列如下所示：5’端标签序列为：TGTAAAACGACGGCCAG(M13上游序列)3’端标签序列为：GGTCATAGCTGTTTCCTG(M13下游序列)。上述方案中，步骤(2)中所述通用引物序列为：M13-FTGTAAAACGACGGCCAGT；M13-RCAGGAAACAGCTATGACC。上述方案中，步骤(2)所述扩增标记反应的PCR反应体系如下：上述方案中，步骤(2)所述扩增标记反应的PCR反应条件如下：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共进行20个循环；72℃10min。上述FISH基因位点探针的制备方法适用于以下所列FISH探针的制备，具体包括：ALK、BCL2、BCL3、BCL6、BCL10、BCL12、BCR、CCND1、E2A、EGFR、ETV6、FIP1L1、HER2、IGH、IGK、IGL、MALT1、MLL(ALL-1、HTRX1、HRX本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种即用型多探针杂交玻片试剂盒，其特征在于，由探针附着玻片、各探针、杂交缓冲液和样本附着玻片组成；所述探针附着玻片上包含若干个相互独立的探针附着区，各探针以冻干的形式分别附着在各相互独立的探针附着区上；所述样品附着玻片上包含若干个相互独立的样品附着区，样品附着区与探针附着区一一对应，样品滴加在样品附着区上，当样本附着区与探针附着区贴合时，样品附着区的样品与相对应的探针附着区的探针实现杂交结合。

【技术特征摘要】
1.一种即用型多探针杂交玻片试剂盒，其特征在于，由探针附着玻片、各探针、杂交缓冲液和样本附着玻片组成；所述探针附着玻片上包含若干个相互独立的探针附着区，各探针以冻干的形式分别附着在各相互独立的探针附着区上；所述样品附着玻片上包含若干个相互独立的样品附着区，样品附着区与探针附着区一一对应，样品滴加在样品附着区上，当样本附着区与探针附着区贴合时，样品附着区的样品与相对应的探针附着区的探针实现杂交结合。2.根据权利要求1所述即用型多探针杂交玻片试剂盒，其特征在于，所述探针附着玻片由探针信息标识区、探针附着区域和杂交玻片接合区组成，所述探针信息标识区上记录了每个独立的探针附着区上对应的探针种类，所述探针附着区域内包含若干个相互独立的探针附着区，探针以冻干的形式附着在探针附着区上，所述杂交玻片接合区的表面附有丙烯酸脂胶水，用于探针附着玻片的包装封膜以及和样本附着玻片的粘结。3.根据权利要求2所述即用型多探针杂交玻片试剂盒，其特征在于，所述探针附着区域为一凹槽，凹槽内含若干个相互独立的探针附着小区块，每个独立的探针附着小区块由探针附着区和外围隔离区组成；每个独立的探针附着小区块之间存在隔离小沟。4.根据权利要求1所述即用型多探针杂交玻片试剂盒，其特征在于，所述样本附着玻片由样品信息记录区、样品附着区和样品隔离区组成，所述样品信息记录区上记录了样本信息，样品滴加在样品附着区上，所述样品隔离区用于防止样品交叉污染。5.根据权利要求4所述即用型多探针杂交玻片试剂盒，其特征在于，所述样品附着区采用亲水材质；所述样品隔离区附有疏水涂层。6.根据权利要求1所述即用型多探针杂交玻片试剂盒，其特征在于，所述杂交缓冲液的组分为：10wt%碳酸亚乙酯、30wt%硫酸葡聚糖、1ugRNaseA、0.6M氯化钠、10mM柠檬酸缓冲液。7.根据权利要求1所述即用型多探针杂交玻片试剂盒，其特征在于，所述各...

【专利技术属性】
技术研发人员：晏星，李雪梅，叶伦，程弘夏，陈刚，
申请(专利权)人：武汉康录生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42