一种制备多能干细胞样细胞的方法、组合物和应用技术

本发明专利技术涉及一种制备多能干细胞样细胞的方法、组合物和应用，本发明专利技术所述方法包括以下步骤：1)在含有细胞生长因子M‑CSF的培养基中培养单核细胞，所述M‑CSF在培养基中的工作浓度为10～50ng/ml，所述培养的时间为3～5天；2)在步骤1)之后，在含有M‑CSF和麦冬高异黄酮的培养基中培养所述单核细胞，其中，所述M‑CSF和麦冬高异黄酮在所述培养基中的工作浓度分别为10～30ng/ml和30～100μg/ml，所述培养时间为4～8天，即得多能干细胞样细胞。与传统的干细胞诱导方式相比，本发明专利技术所述方法具有操作简单、诱导效率高以及性价比高的优点。

A method, composition and application for the preparation of pluripotent stem cell like cells

The present invention relates to compositions and methods of use and preparation of a pluripotent stem cell like cells, the method of the invention comprises the following steps: 1) monocytes cultured in the medium containing cell growth factor M CSF, the M CSF in the concentration of the medium is 10 ~ 50NG /ml time, the training for 3~5 days; 2) in step 1) after culturing the mononuclear cells in the medium containing M CSF and Mai Donggao isoflavone, the M CSF and homoisoflavonoids in Ophiopogon japonicus concentration in the culture medium were 10 ~ 30ng/ml and 30~100 g/ml, the training time for 4~8 days, to obtain pluripotent stem cell like cells. Compared with the traditional stem cell induction method, the method described in the present invention has the advantages of simple operation, high induction efficiency and high cost performance.

【技术实现步骤摘要】
一种制备多能干细胞样细胞的方法、组合物和应用
本专利技术涉及干细胞修复领域，具体而言，涉及一种制备多能干细胞样细胞的方法、组合物和应用。
技术介绍
干细胞是处于分化阶段前的未分化细胞，按照分化能力的不同，大致可以分为全能干细胞(Totipotentstemcells)、多能干细胞(Pluripotentstemcells)和单能干细胞(MonopotentStermCells)。其中，全能干细胞是指受精卵到卵裂期32细胞前的所有细胞，其具有形成完整个体分化潜能；而多能干细胞具有分化成多种细胞的能力，可以形成各种细胞和器官，但无法形成完整个体；而单能干细胞，又名专能干细胞或偏能干细胞，只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。全能干细胞是由能够发育成人的胚胎产生，容易引发伦理问题。单能干细胞的分化能力有限。而多能干细胞较少涉及伦理问题且具有多种分化潜能，因此成为当前干细胞研究的热点和焦点。多能干细胞的研究不仅具有重要的理论意义，而且在疾病治疗、组织和器官修复和再生方面具有极大的应用价值。目前，国内刘光慧等利用基因编辑技术改造抗逆相关基因，获得抗逆特异性高的基因增强型间充质干细胞，用于抵抗细胞衰老以及组织修复。美国哥伦比亚大学和爱荷华大学的科学家通过CRISPR/Cas9基因编辑技术诱导病患多能干细胞分化的方式实现眼疾色素性视网膜炎相关缺陷基因的修复。最近，国内研究人员将病人的皮肤细胞诱导成iPS细胞后，利用CRISPR/Cas9技术介导同源重组的方式修复突变的血红蛋白基因，再将修复的iPS细胞定向诱导分化为造血干细胞，移植到病人体内，治疗人类的镰刀形贫血症。尽管已经在各方面取得可喜进展，但现有的多能干细胞技术仍然存在诸多风险和不足，妨碍多能干细胞技术的应用，其中包括：(1)迄今为止，本领域仍难以以合理费用获得大量满足临床治疗要求的多能干细胞：1)、干细胞来源受限制：目前，多能干细主要从骨髓、外周血、肝脏和胎盘等组织器官中分离，而干细胞在骨髓中的数量仅为1/10000，在外周血中的占比仅为1/250000，在肝脏中占比为1/100000，要获取临床治疗需要的干细胞量对供者机体有压力；胎盘来源的干细胞数量虽然优于骨髓、外周血和肝脏，但受到伦理和致瘤性的限制；2)、诱导型多能干细胞(iPS)需要在体细胞中转入Oct4、sox2、c-Myc、KLF4等基因，操作方式复杂，成本高且存在细胞癌变风险高的缺陷；3)、利用M-CSF、IL-3、IL-6、IL-2和抗CD-13抗体等的组合，诱导形成多能干细胞，制备过程中需要使用多种细胞因子或抗体的组合，成本高，且成体细胞去分化形成多能干细胞的效率低。(2)就治疗效果而言，多能干细胞对损伤或坏死组织的修复，尤其是炎症部位的损伤或坏死组织的修复能力差，治疗效果不理想。因此，本领域有必要对现有多能干细胞制备方法和治疗方式进行改进，以期简化操作、降低成本、提高多能干细胞的制备效率以及治疗效率。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种诱导形成多能干细胞样细胞的方法，所述方法通过M-CSF、以及M-CSF和麦冬高异黄酮的组合，可以有效地诱导单核细胞形成多能干细胞样细胞，与传统的干细胞诱导方式相比，具有操作简单、诱导效率高以及性价比高的优点。本专利技术的第二目的在于提供一种同时诱导形成多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的方法，所述方法通过M-CSF、以及M-CSF、麦冬高异黄酮和灵芝三萜的组合，可以同时获得多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞，无需分别诱导，操作方法简单、快捷。本专利技术的第三目的在于提供一种组合物，所述组合物包括根据前述方法制成的多能干细胞样细胞，或多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞，能够有效地对损伤或坏死细胞、组织或器官进行修复。本专利技术的第四目的在于提供前述组合物在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。本专利技术的第五目的在于提供前述组合物在制备治疗缺血性病变的药物中的应用。本专利技术的第六目的在于提供前述组合物在制备治疗神经系统退行性病变的药物中的应用。本专利技术的第七目的在于提供前述组合物在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。本专利技术的第八目的在于提供前述的组合物在制备治疗肝硬化或慢性肝炎的药物中的应用。本专利技术的第九目的在于提供前述的组合物在制备治疗慢性肾功能不全或肾小球肾炎的药物中的应用。本专利技术的第十目的在于提供前述的组合物在制备治疗糖尿病、糖尿病并发症以及严重型代谢综合征后群的药物中的应用。本专利技术的第十一目的在于提供前述的组合物在制备治疗疾病消耗症候群的药物中的应用。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种诱导形成多能干细胞样细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)在含有细胞生长因子M-CSF的培养基中培养单核细胞，所述M-CSF在培养基中的工作浓度为10～50ng/ml，所述培养的时间为3～5天；2)在步骤1)之后，在含有M-CSF和麦冬高异黄酮的培养基中培养所述单核细胞，其中，所述M-CSF和麦冬高异黄酮在所述培养基中的工作浓度分别为10～30ng/ml和30～100μg/ml，所述培养时间为4～8天，即得多能干细胞样细胞。黄酮(flavone)是指两个具有酚羟基的苯环，通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。现有的一些研究结果表明，黄酮类化合物对干细胞的增殖、凋亡和分化起到调控作用，但目前尚未见关于黄酮类化合物与单核细胞去分化形成干细胞样细胞的相关报道。为探究黄酮与单核细胞去分化之间的关系，以及为筛选获得能够诱导单核细胞形成干细胞样细胞的药物，本专利技术使用多种不同类型的黄酮对单核细胞进行刺激。结果令人吃惊地发现，麦冬总黄酮(即，麦冬高异黄酮)与M-CSF配合，能够有效地抑制单核细胞标志物CD14的表达，促进干细胞标志物CD90的表达；同时，细胞的形态也相应发生变化，细胞体积变大，细胞边缘出现伪足，表现出干细胞的形态特征。后续的诱导分化试验也进一步证实，根据本专利技术所述方法制备的干细胞能够在不同条件下诱导形成类肝细胞、类神经细胞和类心肌细胞，展现出分化成多种特化细胞的“多能干细胞”特性。而其他类型的黄酮，例如大豆总黄酮、淫羊藿总黄酮等并不能抑制CD14的表达、促进CD90的表达，也无法刺激单核细胞表现出干细胞样细胞形态。与常规转基因诱导形成诱导型多能干细胞(iPS)的方法相比，本专利技术所述诱导方法不需要在单核细胞中导入Oct4、sox2、c-Myc、KLF4等基因，通过简单的刺激即可获得多能干细胞，具有操作简单、癌变风险低等优点。另外，与细胞因子组合相比，本专利技术所述方法在诱导过程中只需要使用单个细胞因子M-CSF，降低使用细胞因子组合诱导的成本。本专利技术还涉及：一种同时诱导形成多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的方法，所述方法包括以下步骤：1)在含有细胞生长因子M-CSF的培养基中培养单核细胞，所述M-CSF在培养基中的工作浓度为10～50ng/ml，所述培养的时间为3～5天；2)在步骤1)之后，在含有M-CSF、麦冬高异黄酮和灵芝三萜的培养基中培养所述单核细胞，其中，所述M-CSF、麦冬高异黄酮和灵芝三萜在所述培养基中的工作浓度分别为10～30ng/ml、30～100μg/ml和100～1000ng本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导形成多能干细胞样细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)在含有细胞生长因子M‑CSF的培养基中培养单核细胞，所述M‑CSF在培养基中的工作浓度为10～50ng/ml，所述培养的时间为3～5天；2)在步骤1)之后，在含有M‑CSF和麦冬高异黄酮的培养基中培养所述单核细胞，其中，所述M‑CSF和麦冬高异黄酮在所述培养基中的工作浓度分别为10～30ng/ml和30～100μg/ml，所述培养时间为4～8天，即得多能干细胞样细胞。

【技术特征摘要】
1.一种诱导形成多能干细胞样细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)在含有细胞生长因子M-CSF的培养基中培养单核细胞，所述M-CSF在培养基中的工作浓度为10～50ng/ml，所述培养的时间为3～5天；2)在步骤1)之后，在含有M-CSF和麦冬高异黄酮的培养基中培养所述单核细胞，其中，所述M-CSF和麦冬高异黄酮在所述培养基中的工作浓度分别为10～30ng/ml和30～100μg/ml，所述培养时间为4～8天，即得多能干细胞样细胞。2.一种同时诱导形成多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)在含有细胞生长因子M-CSF的培养基中培养单核细胞，所述M-CSF在培养基中的工作浓度为10～50ng/ml，所述培养的时间为3～5天；2)在步骤1)之后，在含有M-CSF、麦冬高异黄酮和灵芝三萜的培养基中培养所述单核细胞，其中，所述M-CSF、麦冬高异黄酮和灵芝三萜在所述培养基中的工作浓度分别为10～30ng/ml、30～100μg/ml和100～1000ng/ml，所述培养时间为4～8天，即得多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：3)收获步骤2)所述多能干细胞样细胞，或多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞，制成细胞悬液。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)所述多能干细胞样细胞，或者所述多能干细胞和M2型巨噬细胞，通过机械方式或者酶解方式从其附着的固相载体上剥离。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括将步骤3)所述细胞悬液冻存或配制成药物组合物。6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述多能干细胞表达多能性标记CD90。7.根据权利要求2～5任一项所述的方法，其特征在于，所述M2型巨噬细胞表达CD68、CD163、CD14和CD16中的一种或多种，优选地，所述M2型巨噬细胞表达CD68和CD163。8.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述麦冬高异黄酮选自6-醛基异麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、甲基麦冬黄烷酮A、6-醛基异麦冬黄酮A和6-醛基异麦冬黄酮B中的一种或多种。9.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述灵芝三萜选自灵芝酸、丹芝酸甲酯、灵芝酸、灵芝醇，灵芝草酸、灵芝烯酸、丹芝醇、灵芝醇、灵芝醛、环氧灵芝醇、灵芝甾酮、灵芝萜二醇、灵芝萜三醇、灵芝萜酮二醇、灵芝萜酮三醇、灵芝孢子酸、赤芝酸、赤芝萜酮、赤芝醇、赤芝萜醇、赤芝孢子内酯、灵芝内酯中的一种或多种。10.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述M-CSF的工作浓度为10、15、20、25、30、35、40、45或50ng/ml；优选地，所述M-CSF的工作浓度为30ng/ml。11.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述M-CSF的工作浓度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30ng/ml；优选地，所述M-CSF的工作浓度为20ng/ml。12.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述麦冬高异黄酮的工作浓度为30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg/ml；优选地，所述麦冬高异黄酮的浓度为60μg...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖敏，张倩，王建开，邵进士，
申请(专利权)人：北京恩诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11