用于高通量测序的基于固相载体膜富集目标核酸的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体提供一种用于高通量测序的基于固相载体膜富集目标核酸的方法，包括：1)将核酸探针文库与固相载体膜相结合形成“探针‑固相载体膜复合体”；2)向含有“探针‑固相载体膜复合体”的杂交液中加入目标核酸，进行目标核酸的富集；3)用清洗液清洗步骤2)中结合有目标核酸的“探针‑固相载体膜复合体”，然后用洗脱液从固相载体膜上洗脱、然后纯化经富集后的目标核酸文库；4)将步骤3)所富集得到的目标核酸文库应用于高通量测序。本发明专利技术可快捷地产生高倍数覆盖、单碱基位移的、用于富集目标核酸的核酸探针不可移动地固定于固相载体膜上，且本发明专利技术具有操作简便，探针获取灵活，成本低廉的特点。

A method for the enrichment of target nucleic acid based on solid phase carrier membrane for high throughput sequencing

【技术实现步骤摘要】
用于高通量测序的基于固相载体膜富集目标核酸的方法
本专利技术涉及生物
，具体提供一种用于高通量测序的基于固相载体膜富集目标核酸的方法。
技术介绍
随着高通量测序的发展，基因组测序成为了高通量、高深度鉴定相关位点变异，进而识别潜在疾病的最主要手段，同时在科研上具有广泛的应用。在医学诊断上，高通量测序可直接获得大量相关位点变异信息，对于精准医疗具有重大意义。但是，基于目前的状况，多数研究目标和诊断目标只占总体样本的一小部分，例如绝大多数已知的疾病相关位点变异存在于基因组某一特定区域，如外显子组，约占人基因组全长的1％-2％左右；线粒体DNA，占人全基因组的比例更低，仅有0.03％左右；由乙肝病毒整合所诱发的肝癌患者中，整合于人基因组上的乙肝病毒DNA占全基因组的比例极低，约占全基因组的0.0001％-0.0005％。虽然人全基因组测序可以实现外显子组与线粒体DNA以及整合于人基因组上的乙肝病毒DNA的覆盖，但要达到数据分析所要求的数据量则花费成本较高，个体化选择富集位点困难，导致在临床与科研上开展广泛的应用较为局限。DNA靶向富集技术并应用到高通量测序，可将基因组目标区域或感兴趣的目标核酸富集后，提高靶区域所占比例。因此，通过DNA靶向富集技术，富集特定疾病相关目标区域，如人外显子组，或者富集感兴趣的目标区域，如人线粒体DNA、感兴趣的基因区域、整合于人基因组上的乙肝病毒DNA，可大幅降低测序成本，潜力巨大。同时，高通量测序又能对测出的序列进行单碱基的观察，具有获得已知序列、部分已知序列甚至未知的序列，因此对临床诊断和科研具有重大意义。同时，针对目标核酸靶向捕获后应用到高通量测序，在检测效果上，与以往的酶促反应/免疫检测等不同，可对核酸序列具体到单碱基的观察。同时，高通量测序中，对于检测样品中比例极低的变异、小范围或大范围核酸之间的相互作用的观察，则需要达到一定的测序深度，而若未对具有变异的目标核酸进行富集，则测序结果中会存在大量的非有用信息的结果，造成测序的浪费，或者费用显著升高以至于很多研究和检测工作难以开展。而经目标核酸靶向捕获后再应用到高通量测序，可大幅降低检测样品中比例极低的变异、小范围或大范围核酸之间的相互作用等所需的成本，富集倍数即为测序成本降低的倍数。目前市场化的多区域长片段的富集产品主要是基于液相分子杂交与磁珠分离方法，如针对人外显子组的罗氏SeqCapEZExomeLibrarySR试剂盒，安捷伦的SureSelectHumanAllExon试剂盒和illumina的RapidCaptureEnrichment试剂盒等。该类方法由于其杂交富集过程的特殊性，首先需通过从已知数据库中获取所要富集的目标序列，经分析并生成所需的单链核酸序列，再通过芯片合成或其它人工制备方式，生成经过基团修饰的单链核酸探针，如带有Biotin修饰等；同时该类方法需要对磁珠或微球等固相载体进行修饰，使其带有可与单链核酸探针修饰的基团共价连接，如Streptomycin，修饰该制备探针和固相载体的过程成本较高。后在液相中核酸探针与目标核酸杂交，再通过核酸探针上的修饰基团与磁珠上的一个特异基团共价连接，形成目标序列：探针：固相载体复合物，富集目标核酸，后再经多次清洗并洗脱。其步骤较为繁琐，同时由于探针制备昂贵、探针标记以及修饰磁珠成本较高，造成目前所能富集的核酸序列的局限。目前已有报导的其他多区域长片段的富集技术，绝大多数均需通过人工合成的方式，合成经修饰的单链核酸探针，同时制备经多次修饰的固相载体。其富集过程也多为先形成核酸探针：靶核酸复合体，再通过核酸复合体：载体富集，获得富集后的靶核酸序列。复合体与载体的结合，则通过核酸探针与固相载体的修饰基团，因此，不可避免的进行探针修饰与固相载体特定基团包被等，故而提高捕获成本，造成步骤的繁琐。DNA靶向富集技术并应用到高通量测序，虽然可降低测序目标核酸的成本，但由于靶向富集技术的不同，如探针量、探针来源和探针制备等，会造成对目标核酸多样性造成影响，进而影响未知序列的富集、检测比例极低的变异、小范围或大范围核酸之间的相互作用。由于目前所流行及通用的核酸富集技术，需通过人工方式合成单链核酸探针，因此，合成的探针越多越密集，所造成的成本越高，如若想达到针对大片段区域目标序列的单碱基覆盖度，其成本巨大，由此造成在探针合成成本和高丰度位点及高深度测序的选择上，处于两难之地。目前市场化的基于PCR技术通过目标位点扩增进行捕获的技术，均需针对特殊位点进行引物设计及人工合成引物，其通量较小，位点的数量需根据引物对的数量来确定。相较于大片段序列富集分析，目标核酸的碱基覆盖度更低。同时由于成千上万对引物的存在，会造成较高的背景，位点之间相互影响，不利于后续的分析。同时，合成引物的成本也较高，越多的引物存在，就会越多的提高成本。用于核酸杂交的固相载体如玻璃，平板，平皿，微球等均需对固相载体进行修饰后，方可特异性结合核酸，如磁珠，需要对磁珠进行修饰后，进而特异性结合核酸。但核酸的结合具有方向性，所能结合的探针量较低，如目前市场化的基于磁珠靶向核酸分子富集产品，其中某一产品的特性为每毫克磁珠可结合20微克双链DNA，而每毫克磁珠价格在240元左右。固相载体膜类如尼龙膜和醋酸纤维膜等膜纸类固相载体，均具有较强的核酸吸附能力，如每1cm2的尼龙膜上可结合400-600微克核酸，而每1cm2醋酸纤维薄膜上可结合80-100微克核酸，同时核酸与膜的结合不需要方向性，因此不必对核酸探针进行修饰。而市场上评价最高的带正电的尼龙膜，每平方厘米的价格则在0.3元左右。在目标核酸富集过程中，探针量与目标核酸量之间的比例是一个重要技术参数。探针的量越多，所能富集到高多样性目标核酸的概率就越大，这对未知序列的富集、检测比例极低的变异、小范围或大范围核酸之间的相互作用具有重要意义。CN103602658A公开了一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，该方法中，探针核酸标记丙烯酰胺基团，在与目标核酸结合后，通过制备包含有目标核酸:探针核酸复合物的丙烯酰胺凝胶，再通过电泳去除非特异性片段。该方法中，目标核酸和探针核酸的杂交时间和条件不能具有较好的调控性，造成背景噪音较高。CN101351564A公开了一种通过靶特异性杂交方法检测核酸，该方法虽然通过固相载体来对目标核酸:探针核酸杂交复合物进行富集，进而获得目标核酸，但所产生的目标核酸:探针核酸复合物为RNA:DNA复合体，目标核酸为RNA而非DNA，这大大缩小了可应用范围。其次，该方法需对固相载体进行一定的特殊修饰，进而富集到靶核酸:探针核酸复合物，增加了成本。同时，该方法只针对特定位点的捕获，并不适用于高通量大规模富集的要求。目前以尼龙膜或醋酸纤维膜或类似物等固相载体膜类为介质进行目标核酸文库的富集，并最终用于高通量测序服务上，还尚无该方面报道及研究。
技术实现思路
针对以上技术现状，本专利技术目的是提供一种用于高通量测序的基于固相载体膜富集目标核酸的方法，所述方法包括：1)将核酸探针文库通过物理、化学和/或光化学方式与固相载体膜相结合，形成“探针-固相载体膜复合体”；2)向含有经过预杂交或未经过预杂交的“探针-固相载体膜复合体”的杂交液中，加入变性后的含有接头序列和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于高通量测序的基于固相载体膜富集目标核酸的方法，其特征在于，所述方法包括：1)将核酸探针文库通过物理、化学和/或光化学方式与固相载体膜进行结合，形成“探针‑固相载体膜复合体”；2)向含有经过预杂交或未预杂交的步骤1)所得“探针‑固相载体膜复合体”的杂交液中，加入变性后的含有接头序列和/或具有不同或相同标签核酸序列的目标核酸，或者再加入具有提高富集效率的组分，以进行目标核酸的富集；3)用清洗液清洗步骤2)中结合目标核酸的“探针‑固相载体膜复合体”，然后再用洗脱液从固相载体膜上洗脱、并纯化经富集后的目标核酸文库；4)将步骤3)所富集得到的目标核酸文库经扩增或不扩增、以制成具有接头序列和/或具有不同或相同标签核酸序列的、能用于高通量测序的目标核酸文库，即得。

【技术特征摘要】
1.一种用于高通量测序的基于固相载体膜富集目标核酸的方法，其特征在于，所述方法包括：1)将核酸探针文库通过物理、化学和/或光化学方式与固相载体膜进行结合，形成“探针-固相载体膜复合体”；2)向含有经过预杂交或未预杂交的步骤1)所得“探针-固相载体膜复合体”的杂交液中，加入变性后的含有接头序列和/或具有不同或相同标签核酸序列的目标核酸，或者再加入具有提高富集效率的组分，以进行目标核酸的富集；3)用清洗液清洗步骤2)中结合目标核酸的“探针-固相载体膜复合体”，然后再用洗脱液从固相载体膜上洗脱、并纯化经富集后的目标核酸文库；4)将步骤3)所富集得到的目标核酸文库经扩增或不扩增、以制成具有接头序列和/或具有不同或相同标签核酸序列的、能用于高通量测序的目标核酸文库，即得。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的核酸探针文库采用如下方法制备：通过生物合成方式和/或生物酶促反应制备双链核酸文库，并进一步制备成与目标核酸结合的核酸探针文库，或者通过人工合成带修饰或不带修饰的核酸探针文库；所述核酸探针文库包括核苷酸序列信息全部已知的、核苷酸序列信息部分已知的、或核苷酸序列信息全部未知的核酸探针文库。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的双链核酸文库具有与目标核酸序列相同、互补、相似或高度同源的序列特征；优选所述双链核酸文库来源于基因组DNA、质粒、柯斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体或病毒DNA可于宿主细胞内进行生物合成的核酸分子。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的双链核酸文库来源于由生物酶促反应制备的具有与目标核酸序列相同、互补、相似或高度同源的核酸文库，包括酶切、聚合酶链式反应(PCR)、DNA转录或RNA反转录成cDNA方式制备。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)还包括：对双链核酸文库构建成为含有扩增接头的双链核酸文库，优选通过所述生物酶促反应扩增来获得用于制备核酸探针文库的双链核酸文库。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的核酸探针文库的制备通过以下步骤制得：1-1)获取并纯化具有与目标核酸序列互补或高度同源序列的基因组DNA、质粒、柯斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、酶切产物、PCR产物、DNA转录产物、RNA反转录所得的核酸文库，经片段化或不经片段化，形成20bp～10kb片段范围；优选150bp～800bp的片段；片段化方式为物理、化学、光化学法或生物酶等方式；优选物理法如超声法、HydroShear和/或生物酶法，优选酶切法；1-2)将步骤1-1)取得的片段通过物理或化学方式变性，即得核酸探针文库。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中固相载体膜为尼龙膜或其衍生物膜、醋酸纤维素膜或其衍生物膜、硝酸纤维素膜或其衍生物膜、或纤维素纸膜或其衍生物膜；优选为中性或带正电的尼龙膜、醋酸纤维素膜、或纤维素纸膜。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂交液为含有磷酸钠缓冲溶液、EDTA和SDS的溶液、或含有磷酸钠缓冲溶液、EDTA、BSA和SDS的溶液，或含有柠檬酸钠缓冲液(SSC),Denhardtsolution和SDS的溶液，或含有柠檬酸钠缓冲液(SSC),Denhardtsolution、SDS和甲酰胺的溶液，或含有SSPE、Denhardtsolution和SDS的溶液，或含有SSPE、Denhardtsolution、SDS和甲酰胺的溶液；优选杂交液为含0.5M磷酸钠缓冲溶液、1mMEDTA、1％(w/v)BSA和7％(w/v)SDS的溶液，或含有5x柠檬酸钠缓冲液(5xSSC),5×Denhardtsolution和1％(w/v)SDS的溶液；所述清洗液为含有磷酸钠缓冲溶液和SDS的溶液；或含有0.2～2xSSC和1％(w/v)SDS的溶液；优选清洗液为含有0.04M磷酸钠缓冲溶液和1.6％(w/v)SDS的溶液；或含有2xSSC和0.1％(w/v)SDS的溶液；含有0.2xSSC和0.1％(w/v)SDS的溶液；或含有0.1xSSC和0.1％(w/v)SDS的溶液；所述洗脱溶液为水、TE缓冲溶液、0.4MNaOH溶液、或0.1％(w/v)SDS溶液。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中进一步包括于80℃～100℃的洗脱液如水溶液、TE缓冲液或0.1％(w/v)SDS溶液中洗脱，或在pH10-12的洗脱液如0.4MNaOH溶液中对被富集的目标核酸进行洗脱。10.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱静，王素云，程慧，
申请(专利权)人：北京茗天基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11