一种蚊虫足样本DNA提取方法及系统技术方案

本发明专利技术属于基因提取技术领域，公开了一种蚊虫足样本DNA提取方法及系统，蚊虫足样本DNA提取方法采用Chelex‑100溶液和蛋白酶K结合的方法用于单只蚊虫足的微量DNA的提取；具体包括：试剂添加、样品处理、裂解。结果表明本发明专利技术与以往的微量组织提取方法如微量DNA提取试剂盒相比，该方法更加简单、快捷、廉价，且对于蚊虫标本保存的方法要求低，可以作为蚊虫分子生物学发明专利技术中获取DNA模版的重要方法，减少了对蚊虫样本的依赖；单只足用于DNA提取不影响对剩下的部分开展形态学等发明专利技术，可以作为蚊虫分子生物学分析中微量DNA样本提取的重要方法，也为其他昆虫微量DNA的提取提供理论依据。

A method and system for DNA extraction of mosquitoes and feet

The invention belongs to the technical field of gene extraction, discloses a mosquito foot sample DNA extraction method and system, method of mosquito foot sample DNA extraction method using Chelex 100 solution and protease K binding for the extraction of trace DNA single mosquito foot; including: reagent adding, sample processing, cracking. The results show that the method as compared to trace DNA extraction kit of the invention and trace organization in the past, this method is more simple, fast and cheap, and the method for mosquito specimens are kept low requirements, important method can be used as mosquito molecular biology invention to obtain DNA template, reducing dependence on mosquitoes; only enough to influence not for the rest of the DNA extraction to carry out morphological method, can be used as an important method for extraction of trace DNA sample analysis of mosquitoes in molecular biology, also for the extraction of other insects and provide a theoretical basis for trace DNA.

【技术实现步骤摘要】
一种蚊虫足样本DNA提取方法及系统
本专利技术属于基因提取
，尤其涉及一种蚊虫足样本DNA提取方法及系统。
技术介绍
蚊科(Culicidae)昆虫是最重要的医学昆虫类群，它能传播疟疾、登革热、流行性乙型脑炎等多种传染病。蚊媒病是人类健康的主要威胁，每年全球有7亿人受感染，其中有上百万人死亡。世界卫生组织(WHO)估计2015年有2.14亿人感染疟疾，43.8万人因疟疾死亡，每年约0.67～1.36亿人感染登革热。目前，疟疾仍是中国主要的公共健康问题。近些年来，尽管疟疾病例明显减少，但输入性恶性疟疾病例逐年增多。登革热正在成为中国人类健康新的威胁，例如：2014年7—10月在广东爆发登革热，病例达到44497例。蚊虫分子生物学专利技术是蚊虫控制措施专利技术的基础，而这些专利技术往往需要使用大量的蚊虫微量样本提取DNA。蚊虫存在大量隐存种，因此蚊虫分类学者不仅要做蚊虫形态学鉴定，还需要进一步的分子鉴定。传统的分子鉴定使用整只蚊虫提取DNA，不仅破坏稀少的样本，而且不利于后续的分子数据与形态特征对应。因此，急需探索一个高效的、微量组织样本的DNA提取技术。另外在功能基因组的专利技术方面，往往需要专利技术不同组织样本的基因表达，由于蚊虫个体小，组织样本不易获得，同样也急需微量组织样本的DNA提取技术。Chelex-100是一种螯合型离子交换树脂。它是由苯乙烯和苯乙二烯组成的聚合物，可以与二价金属离子螯合，高选择性地去除样品和缓冲液中的金属离子，从而避免样品中存在的金属离子在高温和低离子强度溶液中作为催化剂使DNA降解。Chelex-100悬液在碱性和100℃水浴条件下可使细胞膜破裂，DNA因而可从细胞核中释放出来。Walsh等人最早使用Chelex-100用于法医生物材料的DNA提取和检验，随后一些报道确认Chelex-100可高效提取微量生物材料的DNA。传统的分子鉴定使用整只蚊虫提取DNA，不仅破坏稀少的样本，而且不利于后续的分子数据与形态特征对应。综上所述，现有技术存在的问题是：现有的微量组织提取方法复杂、成本高，且对于蚊虫标本保存的方法要求高，单只足用于DNA提取会影响对剩下的部分开展形态学分析。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种蚊虫足样本DNA提取方法及系统。本专利技术的提取方法基于Chelex-100和蛋白酶K进行蚊虫足样本DNA提取。本专利技术是这样实现的，一种蚊虫足样本DNA提取方法，所述蚊虫足样本DNA提取方法采用Chelex-100溶液和蛋白酶K结合的方法用于单只蚊虫足的微量DNA的提取；具体包括：试剂添加：将枪头用剪刀剪去尖部，取Chelex-100溶液加入到EP管中，另取蛋白酶K2μL加入到所述EP管中；样品处理：取蚊虫的单个后足或中足置于混有Chelex-100溶液和蛋白酶K的EP管中，并用枪头或研磨棒将整根蚊腿捣碎后，涡旋震荡，并离心混匀；裂解：将经过处理的样品置于恒温水浴锅中水浴，然后升温水浴，最后以离心，取上清液作为所提取的基因组DNA模板。进一步，试剂添加中，具体包括：将100μL的枪头用剪刀剪去尖部，取质量分数为5％的Chelex-100溶液加入到50μL～250μLEP管中。进一步，样品处理中，具体包括：取蚊虫的单个后足或中足置于混有Chelex-100溶液和蛋白酶K的250μLEP管中，并用枪头或研磨棒将整根蚊腿捣碎后，涡旋震荡30S，并离心混匀。进一步，裂解中，具体包括：将经过处理的样品置于56℃恒温水浴锅中水浴6h，然后升温到95℃水浴3min，最后以14000r/min离心3min，取上清液作为所提取的基因组DNA模板。本专利技术的另一目的在于提供一种蚊虫足样本DNA提取系统。本专利技术的优点及积极效果为：结果表明与以往的微量组织提取方法如微量DNA提取试剂盒相比，该方法更加简单、快捷、廉价，且对于蚊虫标本保存的方法要求低，可以作为蚊虫分子生物学分析中获取DNA模版的重要方法，减少了对蚊虫样本的依赖。单只足用于DNA提取不影响对剩下的部分开展形态学等专利技术，可以作为蚊虫分子生物学分析中微量DNA样本提取的重要方法，也为其他昆虫微量DNA的提取提供理论依据。附图说明图1是本专利技术实施例提供的蚊虫足样本DNA提取方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的5个基因片段扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理作进一步描述。如图1所示，本专利技术实施例提供的蚊虫足样本DNA提取方法包括以下步骤：S101：试剂添加：将100μL的枪头用剪刀剪去尖部，取质量分数为5％的Chelex-100溶液加入到50μL～250μLEP管中，另取2μL蛋白酶K加入所述EP管中；S102：样品处理：取蚊虫的单个后足或中足置于上述混有Chelex-100溶液和蛋白酶K的EP管中，并用枪头或研磨棒将整根蚊腿捣碎后，涡旋震荡30S，并离心混匀；S103：裂解：将经过处理的样品置于56℃恒温水浴锅中水浴6h，然后95℃水浴3min，最后以14000r/min离心3min，取上清液作为所提取的基因组DNA模板。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述。本专利技术将不同方法保存的不同蚊种的足作为实验材料，从中提取蚊虫基因组DNA；将提取蚊虫基因组DNA作为模板，扩增核糖体DNA的D2，D3和ITS2区，以及线粒体COI和COII基因，并对PCR扩增产物进行测序。具体包括：1、材料与方法1.1供试材料用于实验的9个样本取自重庆师范大学昆虫与分子生物专利技术所常年野外采集及实验室饲养种群的蚊虫，具体样品信息及编号见表1。表1用于蚊虫DNA提取的样品Tab.1MosquitosamplesusedforDNAextraction1.2试剂本专利技术中的主要试剂有：Chelex-100(C7901，Sigma公司)，蛋白酶K(规格：20mg·mL-1，Takara公司)，无菌水(双蒸水，121℃灭菌)，2×TaqMasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)，Chelex-100溶液(称取一定质量的Chelex-100用无菌水配成质量分数为5％的溶液，4℃冰箱保存)。1.3主要实验仪器及设备本专利技术中的主要实验仪器及设备参见表2。表2主要实验仪器及设备Tab.2Maininstrumentandequipmentfortheexperiment1.4微量组织DNA的提取1.4.1试剂添加将100μL的枪头用剪刀剪去尖部少许，取质量分数为5％的Chelex-100溶液(预先摇匀)50μL到250μLEP管中，另取2μL蛋白酶K加入其中。1.4.2样品处理取蚊虫的单个后足或中足置于上述EP管中，并用枪头或研磨棒将整根蚊腿捣碎后，轻微涡旋震荡30s，并离心混匀。1.4.3裂解将经过处理的样品置于56℃恒温水浴锅中水浴6h，然后95℃水浴3min，最后以14000r·min-1离心3min，取上清液作为所提取的基因组DNA模板。1.5PCR扩增和测序PCR反应总体积为25μL，PCR扩增的反应体系为：模板DNA1μL，正反向引物(10μmol·L-1)各1μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蚊虫足样本DNA提取方法，其特征在于，所述蚊虫足样本DNA提取方法采用Chelex‑100溶液和蛋白酶K结合的方法用于单只蚊虫足的微量DNA的提取；具体包括：试剂添加：将枪头用剪刀剪去尖部，取Chelex‑100溶液加入到EP管中，另取2μL蛋白酶K加入到所述EP管中；样品处理：取蚊虫的单个后足或中足置于混有Chelex‑100溶液和蛋白酶K的EP管中，并用枪头或研磨棒将整根蚊腿捣碎后，涡旋震荡，并离心混匀；裂解：将经过处理的样品置于恒温水浴锅中水浴，然后升温水浴，最后以离心，取上清液作为所提取的基因组DNA模板。

【技术特征摘要】
1.一种蚊虫足样本DNA提取方法，其特征在于，所述蚊虫足样本DNA提取方法采用Chelex-100溶液和蛋白酶K结合的方法用于单只蚊虫足的微量DNA的提取；具体包括：试剂添加：将枪头用剪刀剪去尖部，取Chelex-100溶液加入到EP管中，另取2μL蛋白酶K加入到所述EP管中；样品处理：取蚊虫的单个后足或中足置于混有Chelex-100溶液和蛋白酶K的EP管中，并用枪头或研磨棒将整根蚊腿捣碎后，涡旋震荡，并离心混匀；裂解：将经过处理的样品置于恒温水浴锅中水浴，然后升温水浴，最后以离心，取上清液作为所提取的基因组DNA模板。2.如权利要求1所述的蚊虫足样本DNA提取方法，其特征在于，试剂添加中，具体包括：将100μL的枪...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫振天，陈斌，司风玲，何正波，付文博，鲜鹏杰，
申请(专利权)人：重庆师范大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50