双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及双歧杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体及其制备方法和用途，属于基因工程领域。本发明专利技术所要解决的技术问题为提供新的高效，安全，能稳定表达的双歧杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体。本发明专利技术双歧杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体，以ｐＧＥＸ－５ｘ－１质粒为骨架，将ｐＧＥＸ－５ｘ－１上的启动子Ｐｔａｃ替换为双歧杆菌的α－淀粉酶基因的启动子ＡｍｙＯ，还含有长双歧杆菌ＫＪ３６质粒的复制蛋白Ｂ序列。本发明专利技术双歧杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体能广泛适用于以双歧杆菌为受体菌的所有外源基因的表达及其基因工程产品的生产，为本领域的相关应用提供了一种新的载体工具，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体及其制备方 法和用途。
技术介绍
双歧杆菌质粒的研究相对较少。1982年，Sgortati等对1461株共24个种的双歧杆菌进行 了质粒的检测，发现四个种(总菌株数的20%)的双歧杆菌即长双歧杆菌、球双歧杆菌、星状 双歧杆菌以及印度双歧杆菌含有质粒。在GenBank中检索到双歧杆菌质粒的记录也只有16个 但没有 一个是可以直接用于外源基因表达的载体。由于自然界双歧杆菌质粒的稀有性，关于双歧杆 菌表达质粒的研究无论从数量还是质量均很薄弱。穿梭质粒是能在两种或两种以上宿主中复制的质粒，大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒是指 在大肠杆菌和双歧杆菌中均能够复制的人工构建的质粒。以大肠杆菌为宿主，有利于转化和 重组子的筛选，并能增加所需DNA克隆片段的检出率，利于保存和操作等优势。1990年 Marteuzzi等从长双歧杆菌B2577菌株中分离出的隐性质粒pMBl，通过限制性内切酶将pMBl质 粒酶切后连接到质粒载体上，对其复制区域的进行了研究，1994年Missich等将pMBl质粒经 限制性酶切和连接酶作用，在体外与pcEM—5zf (+)质粒重组，成功地构建了大肠杆菌-长双 歧杆菌的穿梭载体pRMl和pRM2。 1996年Rossi， Marteuzzi等以pMBl复制子为基础，构建了 大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体pDG7，这是最早关于双歧杆菌表达质粒的报道。 1998年 Rossi等以pDG7为基础进一步将此质粒载体改建为质粒pDLI41， pDGA7和pDC07，分别用以表 达荧光假单胞菌脂酶，芽胞杆菌淀粉酶和链霉菌胆固醇氧化酶，这是最早报道具有实用 价值的双歧杆菌表达载体的例子。此后的双歧杆菌表达载体大多以此为骨架进行改造。1997 年Matsumura H等以长双歧杆菌质粒为骨架构建了pBLES100表达载体 ， 2002年T0SHIYUKI Nakamura等用它表达胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)基因用于实体瘤的基因治疗研 究。国内对大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体的研究非常有限。2006年韩庆旺等以质粒 pDG7、 pBCSK(+)、 pET-9C为基础，构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体pET-1128，并将人内皮抑素基因插入到新构建的表达载体中表达"」。2006年，侯鑫等以pMBl复制基因片段和 hu启动子为元件，以pMD18-T为骨架，构建了大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体pMB-HU，并 表达了抑癌基因PTEN，但从源流上讲，与pET-1128—样，均属于pMBl质粒系列。至于2001 年刘文华等报道的转内皮抑素基因双歧杆菌制剂对肺癌的疗效和任启伟等2004年报道的重 组胞嘧啶脱氨酶基因的婴儿双歧杆菌表达胞嘧啶脱氨酶对鼠黑色素瘤B16—F10细胞的杀伤效 应研究，质粒分别是大肠杆菌质粒pBV220和pGEX-lLambdaT，其复制元件均为pBR322的复 制序列，稳定性差。虽然pMBl的复制序列来自双歧杆菌，使质粒的稳定性大大改善，但删除 了pMBl的复制序列的复制起始位点W ，使质粒复制的调控受到影响，在一定程度上影响了质 粒的稳定性。而且在上述的报道中，除侯鑫等以双歧杆菌的hu启动子构建的pMBl重组载体外 ，其余的载体均以大肠杆菌的LacZ或其衍生序列Tac制成，需要用IPTG ( Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，异丙基-B-D硫代半乳糖苷)调控才能表达， 而IPTG具有一定的毒性，这在很大程度上限制了它在基因治疗和口服疫苗研制中的应用。总体而言，大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体的构建和优化筛选仍然是双歧杆菌基因工程研 究和发展的弱点和重点，上述穿梭载体转化大肠杆菌与双歧杆菌的效率不同，对双歧杆菌转 化效率还有待于提高，稳定性也有所欠缺；而且目前的穿梭载体的来源单一，需要有使用新 的思路和基本元件构建效率更高、更稳定的穿梭载体，为本领域提供新的载体工具。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体。 本专利技术双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体，以pGEX-5x-l质粒为骨架，含有双歧杆菌的a -淀粉酶基因的启动子Amy0，还含有长双歧杆菌KJ36质粒的复制蛋白B序列。其中，所述双歧杆菌的a -淀粉酶基因的启动子八1^0替换了口0￡乂-5^1上的启动子？1￡^。 进一步的，上述的pGEX-5x-l质粒缺失了LacIq片段。进一步的，上述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体具有SEQ ID NO. l所示的核苷酸序列进一步的，上述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体还带有抗性筛选基因。比如带有 氨苄青霉素抗性筛选基因，能使转入上述双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的重组菌在含有 50y g/ml氨苄青霉素的MRS培养基上生长，用于筛选重组菌。进一步的，上述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体还含有可表达的外源基因。更进一 步的，上述的外源基因为人产肠毒素大肠杆菌的不耐热肠毒素B亚单位基因。本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种制备上述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的方法，该方法包括以下步骤a、 以双歧杆菌的a -淀粉酶基因的启动子AmyO替换pGEX-5x-l上的Ptac启动子；b、 将长双歧杆菌KJ36质粒的复制蛋白B序列酶切后连接到步骤a所得的质粒上，转化大 肠杆菌，筛选，检测确认后即得。进一步的，上述方法的步骤a中还要删除pGEX-5x-l质粒的LacIq片段。本专利技术所要解决的第三个技术问题是提供了含有上述所述双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达 载体的宿主细胞。进一步的，所述的宿主细胞为双歧杆菌或大肠杆菌。本专利技术所要解决的第四个技术问题是提供上述的宿主细胞在制备口服疫苗或口服疫苗的 粘膜免疫佐剂中的用途。本专利技术所要解决的第五个技术问题是提供一种口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂，该 口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂是上述的宿主细胞添加药学上可接受的辅料或辅助性成 分制备而成的。本专利技术中涉及使用的现有的核苷酸序列均能在已发表的本领域学术刊物及GenBank中检 索而得，本领域普通技术人员均能在参考本领域教科书或试验手册的基础上完成本专利技术涉及 的分子生物学和细胞生物学试验。本专利技术的有益效果为本专利技术双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体创造性地采用双歧杆菌 质粒pKJ36的复制子作为重组载体在双歧杆菌中稳定复制的基本复制元件，与现有技术中使 用的pMBl系列相比，保留了复制起始位点的重复序列，重组质粒的复制受到严格的调控，因 此，增加了重组质粒的稳定性，并同时具有双歧杆菌质粒的复制起始元件和大肠杆菌的复制 起始元件。另外还创造性地使用双歧杆菌a -淀粉酶基因的启动子作为重组质粒驱动外源基 因表达的启动子， 一方面该启动子在双歧杆菌中广泛存在，是淀粉代谢的主要酶类，因此， 在双歧杆菌中很容易使外源基因高效地表达；另一方面，该启动子不需要特殊的调控因子， 很适合在体内表达外源基因，免去了调控因子的毒性(如ITPG)和增加的生产成本，具有良 好的生物安全性。本专利技术双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体中可以用来携带如人产肠毒素大 肠杆菌的不耐热肠毒素B亚单位基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双歧杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体，其特征在于：以ｐＧＥＸ－５ｘ－１质粒为骨架，含有双歧杆菌的α－淀粉酶基因的启动子ＡｍｙＯ，还含有长双歧杆菌ＫＪ３６质粒的复制蛋白Ｂ的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马永平，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]