本发明专利技术涉及一种重组双歧杆菌ｈＲＶ－ＶＰ７表达载体及其口服疫苗。属于基因工程领域。所要解决的技术问题为构建新ｈＲＶ病毒ＶＰ７蛋白的双歧杆菌表达载体。本发明专利技术重组双歧杆菌ｈＲＶ－ＶＰ７表达载体装载有人Ａ组轮状病毒的病毒蛋白ＶＰ７的编码基因序列。本发明专利技术表达载体可转入双歧杆菌，发酵培养后进一步制备成转ｈＲＶ／ＶＰ７基因的双歧杆菌－ｈＲＶ／ＶＰ７重组载体口服活疫苗制剂。主要用于预防和辅助治疗人轮状病毒的感染引起的小儿腹泻，具有很好的市场前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种重组双歧杆菌hRV-VP7表达载体及其口服疫苗
技术介绍
人A组轮状病毒(human rotavirus, hRV)是引起新生儿严重腹泻的主要病原体，约60%的 严重腹泻由RV引起的，全球每年有大约50万的婴幼儿因感染RV而死亡，因此，WHO将RV疫苗 的研究放在优先发展的位置。目前，全球RV疫苗研究的方向主要是人工重配减毒口服活疫苗，其中最有影响力的是 Wyeth-Ayerst公司生产的口服疫苗，但由于安全问题很快退出市场(商品名为Rotashield ，1999年6月因接种者出现肠套叠而主动撤回)。近两年RIX4414「12—③和RotaTeq「W相继 进行了临床3期试验的报道。在中国，目前只有兰州生物制品所的羊轮状病毒株PG1()W于 1998年获准生产应用，这是我国目前唯一获国家批准的RV疫苗，但据临床反映，免疫效果 并不理想。因此，hRV疫苗的研制工作仍然任重道远。动物模型研究表明，用VP7的DNA疫苗或病毒样颗粒肌肉免疫小鼠，血液中虽然产生病毒 特异性中和抗体，却对小鼠没有保护作用，只有通过粘膜免疫系统接种的RV疫苗才有免疫保 护作用。因此，最有效的RV疫苗必然是有能力刺激肠道产生消化道局部免疫的疫苗。由 此决定了RV疫苗的最佳剂型是引起粘膜免疫的口服疫苗。基因工程载体疫苗是利用载体系统表达病毒保护性抗原构建新型疫苗的一种模式，其优 点是避免了病毒身的毒副作用，缺点是难以找到理想的载体菌(表达系统)，即使有表达， 免疫原性也较弱。服V的主要保护性抗原是病毒蛋白(Virus Protein) VP4和病毒蛋白VP7。 VP7是分子量为34 kD的外壳糖蛋白，编码基因随病毒的不同型别而定，目前已经发现14个 VP7血清型(G1 G14)，其中常见的感染婴儿的RV为G1-G4型。研究证实，原核系统表达的 全长VP7多肽无免疫原性，用它做候选抗原的缺点是不同G血清型的病毒产生的抗体间没有交 叉保护，因此在临床上的保护范围较窄。但在天然的病毒中VP7蛋白的含量很高，经过去除 3端的部分序列，原核系统表达的VP7仍然可以具有免疫原性，因此，VP7仍然可以 做为基因工程亚单位活疫苗研究的侯选抗原之一。在PubMed中检索到单独把VP7作为亚单位 侯选疫苗抗原的在人腺病毒中表达报道，鼻腔接种免疫小鼠后能够激发保护性免疫反应。Choi NW等则利用转基因烟草表达出了有免疫原性的VP7融合蛋白。在国内，李晋涛等 用转基因马铃薯表达了hRV VP7蛋白。但所用载体系统效率不够高，且均未能进入实用 阶段。据统计，在我国人群中流行的主要RV有Gl (P1A)占72.7%、 G2 (P1B) 12. 1%、 G3(P1A)14. 2。/。和G4 (P1A) 2.5%，可见，hRV流行株以Gl基因型为主。肠道粘膜免疫系统是执行消化道免疫的第一道防线。由于RV的感染和复制仅局限在小肠 上皮细胞中，因此，肠道粘膜免疫在防止RV感染中有举足轻重的作用。双歧杆菌( Bifidobacterium sp.下文简写为B)属于革兰氏阳性菌，是人类肠道的正常菌群，能通过 细胞表面的磷壁酸吸附在小肠上皮细胞表面的受体上，本身不会被肠道清除，能在肠道内稳 定定植，也对机体无害，具有很高的安全性，双歧杆菌还可能发挥粘膜免疫增效剂和辅助治 疗作用。Qiao等的工作证明m，用猴RV (RRV)感染小鼠5天后，实验组(B+RRV)在病毒感染 后每天饲喂一定量的双歧杆菌，对照组(RRV)饲喂等量的盐水，阴性对照不感染病毒，也 不给双歧杆菌，只饲喂等量的盐水，结果发现，实验组血清和粪便中的RRV特异性IgG和IgA 高于对照组。实验组的病愈期也比对照组有所提前。目前只有将双歧杆菌用于人实体瘤基因治疗的基因转移系统的研究报道，但将双歧杆 菌用于制备重组RV病毒蛋白活疫苗在国内外均未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种重组双歧杆菌hRV-VP7表达载体。 本专利技术重组双歧杆菌hRV-VP7表达载体装载有人A组轮状病毒的病毒蛋白VP7的编码基因 序列。其中，上述的双歧杆菌表达载体为大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体。 其中，上述的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体具有SEQ ID NO. l所示的核苷酸序列。 其中，上述人A组轮状病毒VP7亚单位具有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。 进一步的，上述重组双歧杆菌hRV-VP7表达载体具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。 本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种含有上述的重组双歧杆菌hRV-VP7表达载 体的宿主细胞。进一步的，上述的宿主细胞为双歧杆菌。本专利技术所要解决的第三个技术问题是提供上述的重组双歧杆菌-hRV/VP7表达载体或上述 的宿主细胞在制备预防或治疗人A组轮状病毒引起的疾病的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫 佐剂中的用途。本专利技术所要解决的第四个技术问题是提供一种预防或治疗人A组轮状病毒弓1起的疾病的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂。该口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂是由上述的宿 主细胞添加药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的。进一步的，上述口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂的剂型为口服液、口服溶液、片剂 或胶囊剂。象流感病毒一样，自然界轮状病毒不同株之间的基因组节段重配和基因内部突变引起 RV的保护性抗原发生很高的变异，导致疫苗研究大大滞后于临床上流行病毒的变异，给疫苗 研究带来很大的困难，因此，模拟病毒自然重配(reassortant)的规律发展RV疫苗是 最合理和有效的策略。但RV重配株的构建与筛选工作难度很大，花费大，耗时长，而最终产 品带有大量非免疫必需的活病毒成分，接种增殖后难免有一定的副作用如发热、腹泻、肠套 叠等，Rotashield的失败就是最好的例子。但是，人工模拟病毒自然重配方式的疫苗发展思 路和较理想的免疫保护效果，无疑为RV疫苗的研究指明了方向。但具体的模拟和重组方案要 有全新的思维。用自然病毒重配研制减毒活疫苗的老路，难以克服减毒活疫苗毒力回复的安 全性问题，以及减毒RV对HIV感染者等免疫缺陷患者的致命危险。同时也无法回避婴幼儿接 种后疫苗增殖导致的肠套叠、发热、腹泻、呕吐等副作用，而且也很难及时获得符合临床预 防要求的新变异株疫苗。本专利技术将保护性抗原成分单独"剥离"出来进行表达重组，探索出一条新的RV重组疫苗 研究之路。本专利技术技术方案模拟病毒自然变异，研制"保护性抗原重组"疫苗，该方案使疫 苗研制工作能够及时根据临床流行株的抗原变异而改变疫苗抗原的重组方式，达到以变应变 的主动效果。因此，用G1型的VP7做为重组疫苗的抗原，就可以预防72。/。以上的RV感染，如果 以G1 、 G2和G3三型的VP7制作重组活疫苗，其保护范围达流行株97. 5%以上，其临床应用 前景非常广阔。本专利技术中涉及使用的现有的核苷酸序列均能在已发表的本领域学术刊物及GenBank中检 索而得，本领域普通技术人员均能在参考本领域教科书或试验手册的基础上完成本专利技术涉及 的分子生物学和细胞生物学试验。本专利技术的有益效果为l.安全多效。双歧杆菌无副作用，能在肠道内稳定定植，也对机体无害，具有很高的安 全性，用它做重组活疫本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组双歧杆菌ｈＲＶ－ＶＰ７表达载体，其特征在于：装载有人Ａ组轮状病毒的病毒蛋白ＶＰ７的编码基因序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马永平，宋方洲，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：85[]
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