高温耐酸性α-淀粉酶的突变株及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种高温耐酸性α－淀粉酶的突变株及其构建方法，是将地衣芽孢杆菌耐高温α－淀粉酶基因经突变后（Ｌｅｕ１３４→Ａｒｇ和Ｓｅｒ３２０→Ａｌａ）获得的高温耐酸性α－淀粉酶基因，通过构建打靶载体，利用同源重组的方法，将其整合到出发菌株地衣芽孢杆菌的基因组ＤＮＡ中，得到了地衣芽孢杆菌突变株，实现高温耐酸性α－淀粉酶的同源高效表达。本发明专利技术中的突变株所产α－淀粉酶在本身耐高温的基础上，酸稳定性也有了明显地提高，为我国酒精、淀粉糖化等淀粉深加工行业提供了更好的工艺条件，降低了成本，节省了能源和工业用粮，满足了一些在酸性条件下进行淀粉原料液化工艺的要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域，尤其是一种高温耐酸性a -淀粉酶的突变株及其构建方法。
技术介绍
a -淀粉酶(a -1， 4-glucan-glucanhydrolase EC 3. 2.1.1)又称为液化型淀粉酶，它 能从淀粉分子的内部任意切开ct-l，4键，产生分子量比较小的麦芽糖糊精。淀粉在ct-淀粉酶的作用下，分子迅速降解，粘度下降，即完成液化。a-淀粉酶具有相当大的商业 价值，广泛应用于淀粉深加工工业、酒精工业、啤酒工业、拧檬酸工业、味精及淀粉糖化 工业、制药工业及纺织业。a-淀粉酶可由微生物发酵产生，也可由植物、动物提取。目 前工业生产上大都以微生物发酵法大规模生产a-淀粉酶。枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜 热脂肪芽抱杆菌、米曲霉、黑曲霉等都是有实用价值的a-淀粉酶产生菌，其中地衣芽孢 杆菌生产的a-淀粉酶因具有热稳定性而被优选使用。耐髙温a-淀粉酶由于具有相当高的热稳定性，因此被广泛应用于啤酒、酒精、制药及食品等行业，是目前工业上用途最广 泛的一种酶。但是，近年来随着淀粉原料深加工行业的发展，要求酶制剂行业需要不断更新和完善 酶的种类以满足工业生产的要求。对于淀粉糖化工业，目前工业上常采用双酶法水解淀粉 制糖，自然pH为4.0-5.0的淀粉浆需经液化和糖化两个过程处理，即先加淀粉酶液化， 再加糖化酶糖化来生产葡萄糖.但是由于目前市售的淀粉酶最适pH为6.5-9.0，而糖化 酶的最适pH为4. 5左右，因此淀粉浆需先加碱调整PH进行液化，液化液还需再加酸调整 pH才能用于糖化，反复调节pH不仅使工艺变得繁琐增加生产成本，引入外源离于，加重 离交负担，而且调节不当还会产生大量的副产物，使葡萄糖收率降低。在我国传统白酒生 产中，随着发酵的进行，酸度不断增加，pH下降，使酶的活性降低，淀粉水解不彻底， 原料大约有12%不能被利用；而在酒精行业中，由于废水的回填，使得原料液pH值降为 4.0-5.0，也不适合a-淀粉酶的作用。味精行业对淀粉水解糖液的质量要求卜分严格， 加工工艺的pfl—般为4.6-4.8。为了给淀粉原料的深加工提供更好的条件，开创新的酶 法工艺，提高收得率、降低消耗、提高产品质量、增加效益，特别对于节约工业用粮，满 足一些在酸性条件下进行淀粉原料液化工艺的要求，开发一种耐酸的高温a-淀粉酶就势 在必行。早在1963年，H本的研究者Yasuji Minoda等人就发现可以用真菌生产耐酸性a-淀粉酶，以后欧洲、美国、韩国、中国等国家都对耐酸性a-淀粉酶进行了研究，其屮得 到的产耐酸性a-淀粉酶的微生物大多为芽孢杆菌和曲霉。1994年，日本宫崎大学的高崎 幸义教授从土壤中分离到一株地衣芽孢杆菌，所产的a-淀粉酶最适pfl为5. 0，最适温度 为90'C。另外，日本科学家今中忠行选育出一株耐酸性的a -淀粉酶产生菌/yr0C0CCM SA ，该菌株所产的a -淀粉酶最适pH为5. 0,在pH5. 0时最适反应温度为lOOC 。运用基因工程手段，构建耐高温耐酸性a-淀粉酶生产菌，是目前各闺研究者最常用的一种育种方法。欧洲的研究者采用基因技术改造fec^7i/s "'c力em'/br啦's来生产耐热 性的耐酸性a-淀粉酶。在原有天然菌株的DNA序列中将N188位的天冬氨酸残基用其它 任何一种氨基酸取代，并使在N15或N197位的蛋氨酸残基缺失，得到的高产菌株所生产 的a-淀粉酶适用的液化pH值可以降低到5.0，且在100-1 IOIC时活性不变。在我国，20世纪70年代时已有人用力砂e/^77t/s/w'ger进行酸性a -淀粉酶的发酵 研究，但未取得进展。90年代时，中科院微生物研究所研究了嗜热真菌7Z er迈o/^ces 7a/w/^77osi/s对a -淀粉酶的生产，该酶的最适温度和pH分别为65"和5. 0，其耐热性较 差。目前商品化应用的真菌月SjDe7^/77tfs ary幼e和i4s/ e/^77^AS airafflK r/的a —淀粉酶 PH范围为5-6，但不耐髙温。江南大学从淀粉加工厂的酸性土壤中筛选到的5aw7hs Wearof力er历o/w7/ws,能够产生两种酸性a -淀粉酶，其最适pH分别为4. 5和5.0，最适 温度为601C，可以应用于一定条件下的酒糟利用和处理。可以看出，目前国内酸性a-淀粉酶的最适温度都低于7piC，由于超过7(TC进行水 解反应时酶活就会大量损失，因此不能适应我国酒精、淀粉糖化等淀粉深加工行业工艺的 要求。为了给淀粉原料的深加工提供更好的条件，需要开创新的酶法工艺；特别是为了节 约工业用粮，就需要运用基因i程手段，获得既耐酸又耐高温的a-淀粉酶的高效表达， 以显著提高经济效益和社会效益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高温耐酸性a -淀粉酶的突变株及 其构建方法。本专利技术是将经过体外定点突变改造后获得的耐髙温及耐酸同时兼顾的a -淀 粉酶突变基因经过与出发菌株地衣芽孢杆菌的基因组DNA同源重组后整合到其基因组上， 使高温耐酸性a-淀粉酶获得了同源高效表达。本专利技术采取的技术方案是一种高温耐酸性a -淀粉酶的突变株，是将出发菌株地衣芽孢杆菌耐高温a -淀粉酶 基因经体外Leul34—Arg和Ser320—Ala突变后所获得的高温耐酸性a -淀粉酶基因取代 原始耐高温a -淀粉酶基因后得到的突变株。而且，所述的出发菌株地衣芽孢杆菌在中国工业微生物菌种保藏管理中心CTCC保藏， 保藏号10181。一种髙温耐酸性a -淀粉酶的突变株的构建方法，其构建方法包括如下歩骤(1) .构建打靶载体pUC-afl^-a/zy^Km-:以地衣芽孢杆菌基因组DNA为模板，各设计 两对特异的PCR引物，扩增耐高温ci-淀粉酶的上游、下游同源性核苷酸片段，得到两个 同源性核苷酸片段，将上游片段、卡那霉素抗性基因、下游片段定向连接入载体中，构建 得到打靶载体pUC-a/zy^-az/T^KnT;(2) .构建打靶载体pUC-a/^d以含高温耐酸性a-淀粉酶基因的重组质粒为模板，设 计特异的PCR引物，扩增高温耐酸性a-淀粉酶基因，将该片段连入载体中，构建得到打 靶载体pUC-a/ /"(3) .获得地衣芽孢杆菌耐高温a-淀粉酶基因缺失株利用打靶载体 pUC-a/zy^-a^iH(nf转化地衣芽孢杆菌原始出发菌株，同源重组其宿主细胞基因组DNA， 卡那抗性基因取代基因组DNA中部分耐高温a -淀粉酶基因，获得地衣芽孢杆菌耐高温a -淀粉酶基因缺失株；(4).获得高温耐酸性a-淀粉酶基因突变株利用打靶载体pUC-afflj^/转化地衣芽孢 杆菌耐高温a-淀粉酶基因缺失株，同源重组其宿主细胞基因组DNA，高温耐酸性a-淀粉 酶基因带有两个突变位点的部分基因取代缺失株基因组中卡那抗性基因，获得地衣芽孢杆 菌高温耐酸性a -淀粉酶基因突变株。而且，所述步骤(l)的耐高温a-淀粉酶的上游、下游同源性核苷酸片段分别为372bp 和350bp。而且，所述歩骤(l)、 (2)中连接基因片段的载体为pUC19;所述步骤(3)、 (4)中卡那抗性 基因来自于枯草芽孢杆菌p冊980质粒，大小为1112bp;所述步骤(2)中含高温耐酸性a-淀粉酶基因的重组质粒为pBE本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高温耐酸性α－淀粉酶的突变株，其特征在于：是将出发菌株地衣芽孢杆菌耐高温α－淀粉酶基因经体外Ｌｅｕ１３４→Ａｒｇ和Ｓｅｒ３２０→Ａｌａ突变后所获得的高温耐酸性α－淀粉酶基因取代原始耐高温α－淀粉酶基因后得到的突变株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，杜连祥，刘逸寒，李玉，王建玲，王春霞，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]