抗坏血酸的定量方法及定量用试剂技术

本发明专利技术涉及一种抗坏血酸的定量方法，这种抗坏血酸的定量方法利用对由还原型抗坏血酸和氧气生成氧化型抗坏血酸和过氧化氢的反应进行催化的抗坏血酸氧化酶（以下将本酶称为ＡＳＯＤ）、定量试样中的抗坏血酸，其特征在于：在水溶性介质中，ＡＳＯＤ存在下，由还原型抗坏血酸和氧气生成氧化型抗坏血酸和过氧化氢的反应和在过氧化物酶存在下使生成的过氧化氢和色源体反应而生成色素的反应在同一反应体系中进行，并定量生成的色素。＄另外，本发明专利技术涉及在该水溶性介质中存在能够将氧化型抗坏血酸还原为还原型抗坏血酸的还原剂的情况下、进行酶反应从而进行总抗坏血酸定量的方法。＄还涉及在利用能够将氧化型抗坏血酸还原为还原型抗坏血酸的还原剂还原该试样中的氧化型抗坏血酸之后，使还原剂的还原能力丧失的化合物存在的情况下进行酶反应，从而进行总抗坏血酸定量的方法。＄本发明专利技术涉及一种用于上述定量方法的抗坏血酸定量用试剂及抗坏血酸定量用试剂盒。＄本发明专利技术方法提供一种也可应用于临床检查的筛选，而且可同时测定多个检测体的简便的抗坏血酸的定量方法。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗坏血酸的定量方法、定量用试剂及定量用试剂盒。抗坏血酸是一种重要的维生素，通常也被称为维生素C，当生物体内不足时会引起坏血症等。并且，近年来抗坏血酸和生物老化的关系受到了关注。因此抗坏血酸的定量非常重要。目前作为定量抗坏血酸的方法，联氨法等化学测定方法、高效液相色谱法等仪器分析方法是众所周知的，但它们存在操作繁琐、定量时需要很长时间等问题。近年发现了用于催化在氧气存在下氧化还原型抗坏血酸而生成氧化型抗坏血酸和过氧化氢的反应的抗坏血酸氧化酶(以下本酶称为ASOD)。已知，试样中的抗坏血酸能够通过测定由该酶反应消耗的氧气量或生成的过氧化氢量而定量。。JP-A-209770/94作为过氧化氢的具体的定量法，公开了化学测定方法，而没有公开使用过氧化物酶的方法。JP-A-23971/96(EP-A-682116)作为过氧化氢的具体的测定方法，公开了在过氧化物酶存在下，使过氧化氢和苯酚等氢给予体或トリンダ-试剂及4-氨基安替比林等偶合物等形成的色源体反应而生成色素，测定由生成色素着色的反应液吸光度的方法。该方法是在过氧化氢生成反应结束，还原型抗坏血酸被完全地转换为氧化型抗坏血酸之后，对生成的过氧化氢进行定量的方法。一般地说，在抗坏血酸或二硫苏糖醇等还原性物质存在下，使用过氧化物酶进行的色素生成反应难于发生，这是公知的。因此，在利用ASOD完全氧化试样中的还原型抗坏血酸、生成过氧化氢结束后，需要进行色素生成反应。在该方法中，虽然利用酶反应，但需要把化学性不稳定的过氧化氢储存在反应液中一次。由于在生物体试样中存在着尿酸、过氧化物酶、胆红素、血红蛋白等还原性物质，生成的过氧化氢被还原性物质消耗，所以通过存储过氧化氢的所述方法不能得到具有重现性的正确的数据，操作繁琐，需要长时间测定。另外，在生物体内存在着还原型抗坏血酸，同时也存在着氧化型抗坏血酸，定量该还原型抗坏血酸和氧化型抗坏血酸总和的总抗坏血酸在临床上很重要。氧化型抗坏血酸通过二硫苏糖醇等还原剂转化为还原型抗坏血酸后，利用ASOD、还原型抗坏血酸能够定量总抗坏血酸。但是，在过氧化物酶存在下使生成的过氧化氢和色源体反应而定量生成色素的方法中，由于受色源体共存的还原剂的影响而难于生成色素。为了解决这个问题，需要在过氧化氢定量前从反应液中消除残留在反应液中的还原剂，操作变得复杂。在试样中成分的分析中，利用将该成分作为底物的氧化酶而生成过氧化氢(下面称为过氧化氢生成反应)、由过氧化氢和色源体生成色素的反应(下面称为色素生成反应)在同一反应体系中进行的方法被公开于JP-A-29297/82(USP4384042)及JP-A-218069/85中。而关于在同一反应体系中对利用ASOD氧化还原型抗坏血酸，使生成的过氧化氢和色源体反应生成色素的反应进行定量的方法，在这些公报中没有任何公开。正如所述，在色素生成反应中由于在抗坏血酸等还原性物质存在下难于生成色素，所以一般认为在同一反应体系中不可能进行过氧化氢生成反应和色素生成反应。但是令人惊奇的是，发现存在即使在还原性物质存在的情况下，在特定条件下也能不受影响而能够定量的色源体，并完成了本专利技术。本专利技术的目的在于，提供一种也可应用于临床检查的筛选，而且可同时测定多个检测体的更简便的抗坏血酸的定量方法、抗坏血酸定量用试剂以及抗坏血酸定量用试剂盒。根据本专利技术，在利用对由还原型抗坏血酸和氧气生成氧化型抗坏血酸和过氧化氢的反应进行催化的抗坏血酸氧化酶(以下将本酶称为ASOD)、定量试样中的抗坏血酸的方法中，在水溶性介质中，ASOD存在下，由还原型抗坏血酸和氧气生成氧化型抗坏血酸和过氧化氢的反应和在过氧化物酶存在下使生成的过氧化氢和色源体反应而生成色素的反应在同一反应体系中进行，通过定量生成的色素能够定量抗坏血酸(以下称为定量方法A)。使能够将氧化型抗坏血酸还原为还原型抗坏血酸的还原剂存在于试样中而适用所述定量方法A，这样能够定量试样中的总抗坏血酸。另外在该方法中，由于通过酶反应而生成的氧化型抗坏血酸再被还原剂还原转化为还原型抗坏血酸，所以氧化和还原反复进行。因此能够容易地定量比较低的浓度的总抗坏血酸(以下称为定量方法B)。对于利用还原剂还原试样中的氧化型抗坏血酸之后，使残留还原剂的还原能力丧失的试样，通过适用所述定量方法A，能够定量试样中的总抗坏血酸(以下称为定量方法C)。根据本专利技术，提供一种ASOD、色源体及过氧化物酶成分组合而成的抗坏血酸定量用试剂(以下称为定量试剂A)。提供一种向定量试剂A中添加能够将氧化型抗坏血酸还原为还原型抗坏血酸的还原剂的成分组合而成的抗坏血酸定量用试剂(以下称为定量试剂B)。而且提供一种向定量试剂B中，添加了能够使还原剂的还原能力丧失的化合物的成分组合而成的抗坏血酸定量用试剂(以下称为定量试剂C)。在本说明书中，所述定量试剂A、B或C也可以由构成这些试剂的任意2种成分或者2种以上成分构成组合物。而且根据本专利技术，提供一种便于对抗坏血酸定量的抗坏血酸定量用试剂盒。本专利技术的定量用试剂能够在所谓的同一试剂体系使用，根据试剂的保存稳定性、操作性、试剂的供给形态等能够做成由多试剂组成的试剂盒。试剂盒只要预备从由各单一的成分及任意的2个以上成分组合而构成的组合物中选择而构成必要成分的试剂盒就可以。组合物应该避免不理想的组合、例如能够使还原剂和还原能力丧失的化合物组合等。试剂盒例示如下。对定量试剂A，可以做成成分由ASOD及过氧化物酶组成的试剂和由色源体组成的试剂构成的试剂盒(以下称为试剂盒A)。对定量试剂B，可以做成由色源体及还原剂组成的试剂和ASOD及过氧化物酶组成的试剂构成的试剂盒(以下称为试剂盒B)。对定量试剂C的成分，可以做成由色源体及还原剂组成的试剂和能够使ASOD、过氧化物酶及还原剂的还原能力丧失的化合物组成的试剂构成的试剂盒(以下称为试剂盒C)。构成定量用试剂及其试剂盒的各试剂也可以是干燥品，为了省去试剂的配制也能够预先做成添加有水性介质的液态试剂。对于所述任意一个定量试剂或试剂盒中的试剂，也可以根据需要适当添加缓冲剂、酶活化剂、防腐剂、稳定剂及表面活性剂等。另外定量时能够使这些成分存在于反应液中。下面对于本专利技术的还原型抗坏血酸的具体定量方法进行叙述。在定量方法A中，把含有还原型抗坏血酸的试样、ASOD、色源体及过氧化物酶加入水性介质例如缓冲溶液中，在20℃～50℃下、使混合物反应1～15分钟。根据生成的色素测定着色的反应液的吸光度的变化，能够从用含有预先已知浓度的还原型抗坏血酸溶液做成的校正曲线中求得抗坏血酸的量。ASOD以氧气为底物，而由于通常氧气存在于水性介质中，所以氧气不需要特别供给。但是在反应前，最好是振荡或搅拌含有还原型抗坏血酸、色源体、ASOD及过氧化物酶等的反应液。在定量方法B中，可向含有抗坏血酸的试样中加入能够将氧化型抗坏血酸还原成还原型抗坏血酸的还原剂。然后对反应混合物实行定量方法A，这样能够定量试样中的还原型及氧化型抗坏血酸的总量。更简便的是，在实施该方法时，向含有抗坏血酸的试样中加入定量试剂B或试剂盒B，使混合物在水性介质中20℃～50℃下、反应3～30分钟。测定由生成的色素着色的反应液的吸光度的变化，能够从预先做成的校正曲线中更简便地求得抗坏血酸的量。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗坏血酸的定量方法，该定量方法利是用对由还原型抗坏血酸和氧气生成氧化型抗坏血酸和过氧化氢的反应进行催化的抗坏血酸氧化酶－以下称为ＡＳＯＤ－定量试样中的抗坏血酸，其特征在于：在水溶性介质中，ＡＳＯＤ存在下，由还原型抗坏血酸和氧气生成氧化型抗坏血酸和过氧化氢的反应和在过氧化物酶存在下使生成的过氧化氢和色源体反应而生成色素的反应在同一反应体系中进行，并定量生成的色素。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：藤代欣也，多贺克之，青山典仁，三池彰，
申请(专利权)人：协和梅迪克斯株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]