一种制备病毒性肝炎集成诊断芯片的方法技术

本发明专利技术公开了一种病毒性肝炎的集成诊断芯片及其制备方法，它是在玻璃芯片上分布有六个区域的微坑阵列，在这六个区域中，依次分别固定有甲、乙、丙、丁、戊、已、庚六种类型的病毒性肝炎的具有诊断意义的特征基因或其引物。这种芯片能及时准确地同时检测六种病毒性肝炎，芯片生产和肝病诊断的成本都很低，因此本发明专利技术具有极大的社会和经济效益。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种病毒性肝炎的集成诊断芯片以及这种芯片的制备方法。病毒性肝炎是一种发病率极高、对人类健康危害极大的传染性疾病，目前发现的就有甲(HAV)、乙(HBV)、丙(HCV)、丁(HDV)、戊(HEV)、庚(HGV)六种类型，以及由这六种病毒感染引起的肝硬化、肝癌。对它们的快速、有效诊断是预防和治疗肝炎的必要前提。为此，各国都投入了大量经费和人力进行这方面的研究，并且发展了一些病毒性肝炎诊断的物理/化学方法，如常见的ELISA测抗原或抗体，PCR测抗原基因等。但传统的免疫学方法都是首先将纯化的抗原或抗体与酶或其它标记物键合，再加相应的底物通过显色或特殊的仪器来测定其相应的抗原或抗体，这些方法化学计量关系较复杂，染料着色的程度和部位也很难控制，操作繁琐，导致假阳性、假阴性较多，成本也高；曾一度流行的PCR方法由于操作复杂，难以标准化导致符合率差等原因而被国家暂时取消。而且，所有这些方法都有一大缺陷，就是效率低。一次只能测一种病原或几次才能鉴定出一种病原，如检测乙型肝炎病毒要进行s、e、e三对抗原、抗体的检测。而现实的情况是病人往往感染了几种病毒，多种肝炎病毒都能感染人体。传统的方法针对有限的几种病原进行检测，未免带有盲目性。为此，急需发展一种标准化的程序和方法，并能够一次性地诊断出受染微生物的种类和受染程度，便于正确、快速地采取治疗措施。基因(或DNA)芯片技术的出现，使这一难题迎刃而解。基因芯片技术是一项堪与计算机芯片技术媲美、具有划时代意义的革命性技术。基因芯片实质上是一种高密度的寡聚核苷酸(DNA探针)阵列，它采用在位组合化学、合成化学和微电子芯片的光刻技术，或者利用其它方法将大量特定序列的DNA探针有序地固定在玻璃或硅衬底上，它能在1平方厘米见方的玻璃片上一次性固定40万个寡聚核苷酸片段，每种探针的空间尺度是10～20微米，在与待测样品DNA作用后，DNA芯片即可检测到大量的生命信息，包括基因识别、鉴定以及基因突变和基因表达等。到目前为止，DNA芯片技术的出现不过几年时间，主要在两方面进行了应用研究，一是用大量寡聚核苷酸探针测定基因序列，使破解人类DNA遗传密码的速度达到常规方法的25倍；二是开发了检测癌症患者p53基因突变的芯片。但是关于病毒性肝炎的集成诊断芯片目前还未见报导。本专利技术的目的是提供一种用于病毒性肝炎的集成诊断的诊断芯片以及制备这种诊断芯片的方法，这种诊断芯片的制备成本和诊断成本较常规的肝炎诊断材料和方法的诊断成本低得多。利用这种芯片，通过一次集成操作就可以同时完成六种病毒性肝炎的定性、定量检测，方便快速地确定有几种病毒感染以及各自的感染程度如何等。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下本专利技术的集成诊断芯片是针对甲(HAV)、乙(HBV)、丙(HCV)、丁(HDV)、戊(HEV)、庚(HGV)六种类型的病毒性肝炎。这六种肝炎病毒在国内外已有大量的分子生物学方面的研究，其具有诊断意义的特征基因的序列已公布，这些特征基因可以通过直接购买，或者运用分子生物学中的基因分离扩增技术来获取首先将病人血清中的肝炎病毒DNA提取出来用作模版，参照公布的基因序列设计引物，PCR或RT-PCR扩增目的基因，然后克隆到质粒上在大肠杆菌中扩增，酶切，纯化备用。利用微电子芯片制造技术将玻璃刻制成集成化网格状排列的微坑芯片，将7种传染性肝炎病毒的具有临检意义的结构蛋白基因分离、纯化，拆分成单链，或者合成这些病毒基因的引物然后定点多拷贝偶联到芯片上，成为病毒性肝炎集成诊断芯片。将病人血清煮沸裂解放出病毒核酸或经多联PCR扩增基因后变性，与肝炎诊断芯片杂交；或者用偶联引物的芯片做原位多联PCR，用DNA双链显色试剂检测杂交信号的位置和多寡判定感染病毒的种类和程度。具体方案如下一种病毒性肝炎集成诊断芯片，它是在玻璃片上分布有六个区域的微坑阵列，在这六个微坑阵列区域中，分别固定有甲(HAV)、乙(HBV)、丙(HCV)、丁(HDV)、戊(HEV)、庚(HGV)六种类型的病毒性肝炎的具有诊断意义的特征基因或者其引物。一种制备病毒性肝炎集成诊断芯片的方法首先将玻璃片刻制成微坑阵列，这些阵列分成六个不同的区域，用表面键合法对玻璃片表面进行功能化预处理，将甲(HAV)、乙(HBV)、丙(HCV)、丁(HDV)、戊(HEV)、庚(HGV)六种类型的病毒性肝炎的特征基因或其引物转移到六个区域的微坑阵列中，并用偶联剂经偶联反应将基因或其引物固定，即得到病毒性肝炎集成诊断芯片。按照本专利技术的技术方案，所述的表面功能化预处理试剂为亲水性硅烷化试剂等。处理条件为常温下0.5～2.5小时。基因或其引物固定时偶联反应条件为偶联剂(0.5～1.5％)+2-乙磺酸的溶液，室温下12～36小时。所用的偶联剂为水溶性碳二亚胺、N-羟基瑚珀酰亚胺或WOODWARD试剂。所得到的病毒性肝炎集成诊断芯片可采用电化学标记、化学发光标记、荧光标记等方法加以检验，标记试剂可为苄基紫晶、水溶性卟林、溴化乙啶、丫啶橙、荧光素。采用本专利技术的技术方案具有以下方面的特点1.采用本专利技术的集成诊断芯片将传统的一种病毒类型需要多次不同的操作改进为将六种肝炎病毒通过一次集成操作就可完成检测，从而使诊断效率提高10倍以上；2.使用这种集成诊断芯片对病毒性肝炎诊断的符合率提高到95％以上；3.芯片的生产成本低，诊断成本相应地也大大降低。我国人口众多，约有2亿肝炎病毒携带者，每年都有上千万的肝炎病人，对其进行及时、快速、准确的诊断，是预防和治疗病毒性肝病的必要前提。本专利技术的病毒性肝炎集成诊断芯片能及时、快速、准确地对患者加以诊断，对国人的健康具有极其重要的意义。因此，本专利技术有广阔的推广应用前景，具有不可估量的经济价值和社会效益。以下结合具体的实施例对专利技术的技术方案作进一步的说明实施例病毒性肝炎集成诊断芯片，是在玻璃片上分布有分成六个不同区域的微坑阵列，在每个微坑阵列区域中，依次分别固定有甲(HAV)、乙(HBV)、丙(HCV)、丁(HDV)、戊(HEV)、庚(HGV)六种类型的病毒性肝炎的具有诊断意义的特征基因。病毒性肝炎集成诊断芯片的制备方法首先将玻璃片刻制成微坑阵列，这些阵列分成六个不同的区域，在常温下用硅烷化试剂对玻璃片表面进行预处理1小时，然后将甲(HAV)、乙(HBV)、丙(HCV)、丁(HDV)、戊(HEV)、庚(HGV)六种类型的病毒性肝炎的特征基因转移到六个不同区域的微坑阵列中，再用水溶性碳二亚胺偶联剂经偶联反应将基因固定，即得到病毒性肝炎集成诊断芯片。所用的偶联剂可为水溶性碳二亚胺，偶联反应条件为1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(1％)+2-乙磺酸(pH6.5)，室温下24小时。权利要求1.一种病毒性肝炎集成诊断芯片，其特征在于它是在玻璃片上分布有分成六个不同区域的微坑阵列，在每个微坑阵列区域中，依次分别固定有甲、乙、丙、丁、戊、庚六种类型的病毒性肝炎的具有诊断意义的特征基因或其引物。2.一种制备病毒性肝炎集成诊断芯片的方法，其特征在于首先将玻璃片刻制成微坑阵列，这些阵列分成六个不同的区域，常温下用硅烷化试剂对玻璃片表面进行表面功能化预处理0.5～2.5小时，然后将甲、乙、丙、丁、戊、庚六种类型的病毒性肝炎的特征基因或其引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种病毒性肝炎集成诊断芯片，其特征在于：它是在玻璃片上分布有分成六个不同区域的微坑阵列，在每个微坑阵列区域中，依次分别固定有甲、乙、丙、丁、戊、庚六种类型的病毒性肝炎的具有诊断意义的特征基因或其引物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王业富，庞代文，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]