重组核酸分子及其应用制造技术

通式Ⅰ的β—内酰胺酶底物，其中Ｘ和Ｙ之一个是发荧光的供体，而另一个是猝灭体（可以、或不可以再发射），Ｒ′选自Ｈ、低烷基（即１—５个碳原子）和（ＣＨ＃－［２］）＃－［ｎ］ＯＨ（其中ｎ是０或１—５整数）；Ｒ″选自Ｈ、生理学可接受的金属或铵阳离子、—ＣＨＲ＃＋［２］ＯＣＯ（ＣＨ＃－［２］）＃－［ｎ］ＣＨ＃－［３］、—ＣＨＲ＃＋［２］ＯＣＯＣ（ＣＨ＃－［３］）＃－［３］、酰基硫代甲基、酰氧—α—苄基、δ—丁内酯基、甲氧羰氧甲基、苯基、甲基亚磺酰甲基、β—吗啉乙基、二烷氨基乙基、酰氧烷基、二烷氨羰氧甲基、和脂肪基（其中Ｒ＃＋［２］选自Ｈ和低烷基）；Ａ选自Ｓ、Ｏ、ＳＯ、ＳＯ＃－［２］和ＣＨ＃－［２］；而Ｚ′和Ｚ″是发荧光的供体和猝灭体部分的接头。也介绍测试β—内酰胺酶活性、并监测使用β—内酰胺酶作为报告基因的体系中的表达之方法。＄（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请系申请日为1996年3月20日、申请号为96193854.4、专利技术名称为“β-内酰胺酶的底物及其应用”的专利技术专利申请的分案申请。本专利技术总的来说涉及化学和生物领域。更具体地说，本专利技术涉及测定基因表达所使用的组合物和方法。报告基因测试可测定基因启动子的活性，该测定吸取分子生物技术之优点，该技术使人们可将异源基因置于任何启动子控制之下，并将该构建体导入哺乳动物细胞的基因组中。启动子激活还诱导报告基因，或者代替内源基因。通过设计，报告基因编码容易检测和测量的蛋白，一般是一种能将市售底物转变为产物的酶。此种转换便于接着进行色谱测量或直接光学测定，并可定量分析所产生的酶量。报告基因在许多研究不同生物体基因调节的各种质粒上，可从市场购得。所研究的启动子可以插入质粒上报告基因前为此目的所提供的多克隆位点上。使用标准技术将这些基因导入细胞型或整个生物体中(例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.克隆基因在培养哺乳动物细胞中的表达，见《分子克隆》，Nolan，C.编辑，New YorkCold Spring Harbor Laboratory出版社出版，1989)。然后可用质粒上提供的抗性标志挑选成功地被转染的细胞。因容易使用，且大量信号扩增，使得该技术在基因调节研究中颇为流行。DNA→RNA→酶→产物→信号这一连串步骤的每一步均使该序列在下一步扩增。越往下测量这一连串步骤的下一步，则获得的信号越多。在理想的报告基因测试中，所研究的启动子控制下的报告基因，被暂时地，或稳定地转染进细胞中。受体激活作用导致通过转录和转译活动而改变酶的水平。通过底物上的酶促作用，可以测量存在的酶量。当加入到胞外溶液中时，该底物是小型不带电分子，可以穿透浆膜与酶相遇。也可以采用带电分子，但该电荷需用基团掩蔽，而所述基团将被内源细胞酶裂解(例如可由胞质酯酶裂解的酯类)。因为很多原因，对于与酶相互作用时其荧光光谱显示变化的底物之应用，特别令人青睐。某些测试中，产生荧光的底物被转换成发荧光产物。另外，随报告基因酶中的转换作用，发荧光底物改变其荧光性质。该产物应是获得极大信号的真正发荧光的，并是真正极性的，能陷入细胞内。为了使报告基因检测中达到可能的最高敏感度，不得不使单个报告基因酶所产生的信号量达极大值。最佳酶在饱和条件下每秒钟能转换105个底物分子。β-内酰胺酶每秒钟能裂解其适意之底物约103个分子。使用一种产生荧光的底物，当以适当波长的光激发时，取决于所用染料类型，每产生一个发荧光产物，可获得至多106个光子。该信号随荧光团的退色而终止。这些数值说明此类测量中可获取信号的理论值。在实践中，将检测出所产生光子的精确分数，但这实际包括荧光、生物发光或化学发光。一种报告基因酶的良好产生荧光底物，除了良好的光学特性，例如高消光和高荧光量子产率外，还必需具有对酶的高转换作用。专利技术概述本专利技术的目的是提供β-内酰胺酶底物化合物。本专利技术的另一目的是提供透膜化合物。该透膜化合物可以转化为基本上不透膜的化合物。本专利技术的又一目的是提供β-内酰胺酶报告基因。本专利技术的另一目的是创建含功能性连接于启动子上的β-内酰胺酶报告基因的细胞，以便当启动子启动时，该报告基因得以表达。用β-内酰胺酶水解之后能发光的β-内酰胺酶底物来测量β-内酰胺酶的表达。本专利技术还有一个目的是利用细胞中的β-内酰胺酶报告基因及本专利技术β-内酰胺酶底物化合物筛选生物化学活性。根据本专利技术，提供的产生荧光的底物具有通式Ⅰ结构， 其中X和Y之一是发荧光的供体部份，或其透膜衍生物，而另一个是猝灭体部份、受体荧光团部份或其透膜衍生物；R′选自H、低级烷基、(CH2)nOH、(CH2)nCOOR″和=NOJ，(其中n是0或1-5的整数，而J是H、Me、CH2COOH、CHMeCOOH及CMe2COOH)；R″选自H、生理学上可接受的金属和铵阳离子、-CHR2OCO(CH2)nCH3、-CHR2OCOC(CH3)3、酰硫甲基、酰氧基-α-苄基、δ-丁内酯基、甲氧羰氧甲基、苯基、甲基亚磺酰甲基、β-吗啉代乙基、二烷氨基乙基、二烷氨基羰氧甲基，其中R2选自H和低级烷基；A选自S、O、SO、SO2和CH2；Z′是X的接头；Z″是Y的接头。另一方面，本专利技术提供测定样品中是否具β-内酰胺酶活性的方法。该方法包括将样品与本专利技术化合物底物接触(当化合物被激发时它表现出荧光共振能量转移)；激发化合物；和测定样品中荧光共振能量转移的程度。荧光共振能量转移程度若低于预期值，则表明存在β-内酰胺酶活性。该方法的一个实施方案是测定样品中的酶量。根据该方法，测定样品中荧光共振能量转移程度包括测定样品与底物接触后第一次和第二次的转移程度，并测定该荧光共振能量转移程度之差，该差值反映出该样品中的酶量。另一方面，本专利技术提供重组核酸分子，该分子包含适宜于在脊椎动物细胞中起作用的表达控制序列，该表达控制序列按人工操作方式(operably)连接于编码β-内酰胺酶表达的核苷酸序列上。也提供包合适宜于在真核细胞中发挥作用，且按人工操作方式连接于编码胞液β-内酰胺酶表达的核苷酸序列上的表达控制序列的重组核酸分子。在某些实施方案中，本专利技术涉及用这些重组核酸分子转染的哺乳动物宿主细胞。另一方面，本专利技术提供测定细胞中β-内酰胺酶活性量的方法。该方法包括提供以重组核酸分子转染的宿主细胞，所述重组核酸分子包含按人工操作方式连接于编码β-内酰胺酶表达的核酸序列上的表达控制序列；将含细胞或细胞提取物的样品与β-内酰胺酶底物接触；以及测定裂解底物之量，而裂解底物之量与β-内酰胺酶活性量有关。再一个方面，本专利技术提供监测按人工操作方式连接于一套表达控制序列的基因的表达的方法。该方法包括提供以重组核酸分子(该分子含按人工操作方式连接于编码β-内酰胺酶表达的核酸序列上的表达控制序列，除了真核细胞是真菌的情况例外，其中所述β-内酰胺酶是胞液β-内酰胺酶)转染的宿主细胞；将含细胞或细胞提取物，或其条件培养基之样品与β-内酰胺酶底物相接触；并测定裂解的底物之量。所述裂解底物之量与β-内酰胺酶活性量相关。再一个方面，本专利技术提供测定是否一种试验化合物能改变按人工操作方式连接于一套表达控制序列的基因之表达的方法。该方法包括提供由重组核酸构建体转染的细胞(所述构建体含有按人工操作方式连接于编码β-内酰胺酶表达的核酸序列上的表达控制序列，除了真核细胞是真菌的情况例外，其中β-内酰胺酶是胞液β-内酰胺酶)；将该细胞与试验化合物接触；将含细胞或细胞提取物之样品与β-内酰胺酶底物接触；并测定裂解的底物之量，而所裂解的底物量与β-内酰胺酶活性量相关。该方法的一个实施方案中，底物是本专利技术化合物。测定裂解的底物量之步骤包括激发化合物；并测定样品中荧光共振能量转移程度。若荧光共振能量转移程度低于预期值，则表明存在β-内酰胺酶活性。还有一个方面，本专利技术提供克隆选择的方法，该方法包括提供用重组核酸分子转染的细胞(所述重组核酸分子含有按人工操作方式连接于编码胞液β-内酰胺酶表达的核酸序列上的表达控制序列)；将该细胞与激活或抑制表达控制序列活化作用的底物接触；将该细胞与转换成底物的权利要求9的化合物接触；测定在各个体细胞中是否底物被裂解，而裂解反映β-内酰胺酶活性；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组核酸分子，它包括适宜于在脊椎动物细胞中发挥功能，并按人工操作方式连接于编码β－内酰胺酶表达的核苷酸序列上的表达控制序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：RY齐恩，G茨卢卡尔尼克，
申请(专利权)人：加州大学评议会，
类型：发明
国别省市：US[美国]