苯丙氨酸羟化酶基因突变诊断专用DNA芯片制造技术

本发明专利技术公开了一种苯丙氨酸羟化酶基因突变诊断专用ＤＮＡ芯片。它是在玻片、硅片、膜、高分子材料上固定检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的特异ＤＮＡ探针，形成中密度ＤＮＡ探针阵列。本发明专利技术与现有技术相比，在一显微镜载玻片大小的载体表面，固定７９×４ＤＮＡ探针，因此可同时检测苯丙氨酸羟化酶已发现的中国人种所有基因突变。具有平行分析和多重分析特点。特定的洗脱条件可以区分全配杂交和单碱基失配杂交。适合于早期诊断，产前筛查苯丙酮酸尿症。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种苯丙氨酸羟化酶基因突变诊断专用DNA芯片。中国是一个遗传病大国。遗传病是由于人体生殖细胞或受精卵的遗传物质发生改变而引起的疾病，从亲代传至后代。通常包括三大类单基因遗传病，染色体遗传病和多基因遗传病。从世界范围讲，新生儿中至少2％有明显的先天异常。虽然大多数遗传病的发病率低(多基因病除外)。然而遗传病种类繁多，因此总数很多。仅单基因遗传病就有4000多种，染色体病有100多种，多基因病也不少于100种。并且目前国际上以平均每年发现100多种新单基因遗传病的速度在发展。这也反应了遗传病带给医学，社会和家庭问题的严重性。绝大多数遗传病目前还没有有效的治疗方法，因此预防就显得尤为重要。若能在妊娠早期诊断出胎儿是否患病，对患病胎儿进行人工流产，可防止患儿出生。产前遗传筛检，辅以人工流产，己证明是一种有效预防严重危害健康的遗传病的方法。我国现有残疾人5000万，其中相当数量是遗传病引起的。由于边远地区和某些农村近亲结婚率高，遗传病发病率仍呈现上升趋势，因此广泛开展产前遗传筛检，杜绝患儿出生，降低发病率，对于我国优生优育，提高人口素质起着重要作用。由于许多遗传病特别是单基因孟德尔型遗传病的基因及基因突变的机制已研究清楚，使我们在基因水平能准确诊断大部分遗传病。在许多发达国家，新生婴儿的遗传筛检很普遍。例如早在60年代，美国法律已规定必须对所有新生婴儿进行苯丙酮酸尿症的筛检。彻底消除了因苯丙酮酸尿症引起的智能障碍儿童的出现。因为如果苯丙酮酸尿症婴儿在出生时便能及时接受特别食谱治疗，就不会出现疾病症状。另外针对特定的新生儿遗传筛检，如针对黑人婴儿的镰刀血球细胞症，犹太婴儿的戴萨克斯症等都已普遍实施。但在中国，由于遗传病种类繁多，传统遗传筛检方法需要较昂贵的仪器，专业人才，高费用等，使我国在产前产后遗传筛检普及方面做得非常不够。希望中国有关方面重视该问题。这对中国的可持续发展问题，人口素质提高问题，社会保障负担问题都有非常深远的影响。举例来说，苯丙酮酸尿症是由于肝脏苯丙氨酸羟化酶(PAN)严重缺乏所致的常染色体隐性遗传病。患者由于苯丙氨酸羟化酶缺乏或不足，造成苯丙氨酸不能按其正常代谢途径转化为酪氨酸，使得苯丙氨酸代谢物在体内大量蓄积，损坏患者的神经系统发育，而导致智力发育障碍。在欧美地区发病率为l/10000，在我国是1/16000。苯丙酮酸尿症婴儿出生时，应立即停止母乳喂养，采用低苯丙氨酸饮食疗法8-10年，才能维持患者智力发育正常，费用昂贵，在我国难以实行。因此实行产前诊断，并辅以人工流产是杜绝患者出生的最有效途径。由于苯丙氨酸羟化酶基因只在肝细胞中特异表达，不能用血细胞，羊水，绒毛细胞进行酶活性检测，因而只能进行基因突变分析。我国尚未全面普及苯丙酮酸尿症产前筛检，以发病率1/16000计，仅此一种遗传病，就使我国有近10万的智能障碍者，给社会造成巨大负担。苯丙氨酸羟化酶(PAN)基因位于12号染色体长臂，即12q22-12q24.1，全长约90kb，包括13个外显子，每个外显子长度在57-892bp之间，全长2.3kb，其阅读框架为1353bp，编码451个氨基酸的多肽链。疾病相关基因突变的检测主要有(1)PCR-RFLP(restriction fragmentlength polymorphism)，该方法利用多种限制性内切酶对基因扩增产物进行酶切，不同的基因序列将产生不同的电泳图谱(Mercier，B.et al.，Eur.J.Immunogenetics，21，105，1994)。该方法只能应用于当突变改变了某一酶切位点时。该方法的改进是在突变位点引入酶切位点法，即PCR-AIRS(attificial introduction of restriction sites)(Cotton，R.G.H.Mut.Res.，285，125，1993)。(2)PCR-SSO(sequence specific oligonucleotide)或PCR-ASO(allele specific oligonucleotide)(Cotton，R.G.H.Mut.Res.，285，125，1993；Saiki，R.K.et al.，Nature，324，163，1986)，待测基因经PCR扩增后，分别与15-20bp标记的野生型和突变型探针杂交。该方法需进行同位素标记或地高辛，生物素，过氧化物酶等标记，分析过程复杂，不适宜快速分析。(3)PCR-SSP(sequence specific primers)或ASPCR(allelespecific PCR)，其原理是根据已知突变位点的性质在引物中设计一错配碱基，使之仅能扩增突变型或野生型基因。该方法较为快速简便。(Wu，D.Y.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，2757，1989；Rust，S.，et al.，NucleicAcids Research，21，3623，1993；Newton，R.et al.，Nucleic Acids Research，17，2503，1989)。(4)PCR-SSCP(single-stranded conformationpolymorphism)，SSCP是指单链DNA分子在中性PAGE中电泳迁移率随其构象改变的性质。因此可作为基因变异的检测方法，最早由Orita用于癌基因点突变和人基因组多态性研究(0rita，M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，2766，1989)，此法仅能检测基因变异的存在，而不能确定突变的部位和内容。(5)DNA测序法是最直观准确的方法。但技术复杂价格昂贵，不能作为常规方法。综上所述，在有关疾病相关基因突变诊断的现有技术中，存在操作繁杂，所需时间长，成本较高，难以自动化及大量样本平行分析等问题。因为PKU病症可以利用低苯丙氨酸饮食进行治疗。所以PKU的早期诊断非常重要。在美国，英国等发达国家，出生婴儿都要进行PKU诊断筛选。现有的PKU基因诊断筛选主要是利用RFLP方法检测苯丙氨酸羟化酶基因的突变，由于苯丙氨酸羟化酶基因的相关突变非常多，RFLP方法难以应付。本专利技术的目是提供一种可同时检测苯丙氨酸羟化酶所有基因突变位点的苯丙氨酸羟化酶基因突变诊断专用DNA芯片。为了达到上述目的本专利技术采取下列措施苯丙氨酸羟化酶基因突变诊断专用DNA芯片是在玻片、硅片、膜、高分子材料上固定检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的特异DNA探针，形成中密度DNA探针阵列，所说探针为Gly46Serwild AATGCACCAACTTCMut AATGCACTAACTTCLeu48Serwild TTTGGCCAATGCACCMut TTTGGCCGATGCACCGlu56Aspwild TATTTGAGGTCAGTAMut TATTTGATGTCAGTALeu98Serwild ATGCCTCAAGATCTTMut ATGCCTCGAGATCTTArg111Term wild TTATCTCGTGAAAGCMut TTATCTCATGAAAGCArgl58Gln wild CTGCTTCCGTCTTGCMu本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苯丙氨酸羟化酶基因突变诊断专用ＤＮＡ芯片，其特征在于在玻片、硅片、膜、高分子材料上固定检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的特异ＤＮＡ探针，形成中密度ＤＮＡ探针阵列，所说的探针为：Ｇｌｙ４６Ｓｅｒ ｗｉｌｄ ＡＡＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＭ ｕｔ ＡＡＴＧＣＡＣＴＡＡＣＴＴＣＬｅｕ ４８Ｓｅｒ ｗｉｌｄ ＴＴＴＧＧＣＣＡＡＴＧＣＡＣＣＭｕｔ ＴＴＴＧＧＣＣＧＡＴＧＣＡＣＣＧｌｕ５６Ａｓｐ ｗｉｌｄ ＴＡＴＴＴＧＡＧＧＴＣＡＧＴＡＭｕｔ ＴＡＴＴＴＧＡＴＧＴＣＡＧ ＴＡＬｅｕ９８Ｓｅｒ ｗｉｌｄ ＡＴＧＣＣＴＣＡＡＧＡＴＣＴＴＭｕｔ ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＴＡｒｇ１１１Ｔｅｒｍ ｗｉｌｄ ＴＴＡＴＣＴＣＧＴＧＡＡＡＧＣＭｕｔ ＴＴＡＴＣＴＣＡＴＧＡＡＡＧＣＡｒｇ１５８Ｇｌｎ ｗｉｌｄ ＣＴＧＣＴＴＣＣＧＴＣＴＴＧＣＭｕｔ ＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＣＴＴＧＣＡｒｇ１５８Ｔｒｐ ｗｉｌｄ ＴＧＣＴＴＣＣＧＴＣＴＴＧＣＡＭｕｔ ＴＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＧＣＡＰｈｅ１６１Ｓｅｒ ｗｉｌｄ ＡＡＧＣＡＧＴＴＴ ＧＣＴＧＡＣＭｕｔ ＡＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＴＧＡＣＴｙｒ２０４Ｔｅｒｍ ｗｉｌｄ ＴＧＴＡＣＴＣＡＴＡＧＣＡＡＧＭｕｔ ＴＧＴＡＣＴＣＣＴＡＧＣＡＡＧＡｒｇ２４１Ｈｉｓ ｗｉｌｄ ＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＣＧＡＭｕｔ Ｇ ＧＴＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＡｒｇ２４３Ｇｌｎ ｗｉｌｄ ＣＡＣＡＧＧＴＧＣＧＡＧＧＣＧＭｕｔ ＣＡＣＡＧＧＴＴＧＧＡＧＧＣＧＰｒｏ２４４Ｌｅｕ ｗｉｌｄ ＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧＡＧＭｕｔ ＡＧＣＣＡＣＡＡＧＴＣＧＧＡＧ Ｇｌｙ２４７Ｖａｌ ｗｉｌｄ ＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＭｕｔ ＧＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＴＬｅｕ２４９Ｈｉｓ ｗｉｌｄ ＧＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＣＴＣＴＭｕｔ ＧＧＣＣＴＧＣＡＴＴＣＣＴＣＴＡｒｇ２５２Ｇｌｎ ｗｉ ｌｄ ＧＡＡＡＴＣＣＣＧＡＧＡＧＧＡＭｕｔ ＧＡＡＡＴＣＣＴＧＡＧＡＧＧＡＰｈｅ２５４Ｉｌｅ ｗｉｌｄ ＴＣＧＧＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＭｕｔ ＴＣＧＧＧＡＴＡＴＣＴＴＧＧＧＬｅｕ２５５Ｖａｌ ｗｉｌｄ ＧＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧ ＧＴＧＧＭｕｔ ＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＧＧＴＧＧＧｌｙ２５７Ｖａｌ ｗｉｌｄ ＴＴＧＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＭｕｔ ＴＴＧＧＧＴ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶邦策，
申请(专利权)人：浙江江南生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]