新蛋白质,其编码基因及它们的使用方法技术

本发明专利技术的目的是筛选和鉴定新的抗微生物蛋白，浓度甚至相对较低的该蛋白质也能抑制植物致病性微生物的生长，所述微生物如Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ和茄属丝核菌，它们能导致损害水稻作物的两种主要疾病。本发明专利技术的另一目的是克隆该蛋白质的基因。根据本发明专利技术，提供了抗微生物蛋白，可通过硫酸铵沉淀法沉淀Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｈｉｍｅｊｉ获得含水提取物级分来获得该蛋白质，其中所述蛋白质具有至少抗茄属丝核菌或Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ的抗微生物活性，其在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法中，显示出分子量约为７０ｋＤａ和／或约为６５ｋＤａ的组分的存在。本发明专利技术还提供了编码该蛋白质的基因和使用它们的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及具有抗微生物活性的新蛋白质，编码该蛋白质的基因和使用所述蛋白质和基因的方法。更具体地，本专利技术涉及源自Lyophyllum shimeji，并具有至少抗茄属丝核菌和Pyricularia oryzae的抗微生物活性的蛋白质，编码该蛋白质的基因，和使用所述蛋白质和基因的方法。 本申请要求1999年9月21日提交的日本专利申请267238/1999(其全部内容列入本文作为参考)的优先权。
技术介绍
已知如壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的裂解酶是具有抗植物致病性微生物的抗真菌或抗微生物活性的植物蛋白质。体外实验证实尽管这些类型的酶单独使用时可以发挥作用(Schlumbaum等，(1986)，自然324，pp365-367，Broglie等，(1991)，科学254，pp1194-1197)，但如果联合使用两种或多种上述酶，一般会获得增强的作用(Mauch等，(1988)，植物生理学，88，pp936-942；Sela-Buurlage等，(1993)，植物生理学，101，pp857-863)。如果用于抑制真菌生长，已知当单独使用这些裂解酶时，需要其使用浓度约为几十至几百μg/ml，或者当联合使用这些酶时，每种酶的浓度约为几μg/ml。然而，就本专利技术人所知道的而言，至今尚未阐明这些裂解酶能够对导致水稻作物大面积受损的Pyricularia oryzae发挥任何抗微生物作用。 以防卫素为例的低分子量抗真菌肽(AFP)也具有抗微生物活性，据报道其中的Ca-AMP1(日本国內公告号505048/96)和CB-1(Oita等，(1996)，Biosci.Biotech.Biochem，60，pp481-483)显示出抗Pyricularia oryzae和茄属丝核菌的抗微生物活性。而Rs-AFP1和Ar-AFP2(Terras等，1992，生物化学杂志，267，pp15301-15309)，以及Ace-AMP1(日本国内公告号501424/97)显示出抗Pyricularia oryzae的抗微生物活性。几μg/ml这些低分子量肽能50％抑制包括上述微生物的植物致病性微生物的生长。 人们也尝试分离裂解酶基因或低分子量抗微生物肽基因，并将这些基因转移至植物，从而构建能耐受疾病损伤的植物(Broglie等，(1991)，科学，254，pp1194-1197；Zhu等，(1994)，Bio/Technology12，pp807-812；Lin等，(1995)，Bio/Techmology13，pp686-691；Terras等，(1995)，植物细胞7，pp573-588)。然而，迄今为止几乎无法得到任何被赋予实践可接受水平的耐受性的植物。据认为一个原因是仅表达了低水平的转移基因。然而，据认为更主要的原因是迄今为止所报道的抗微生物蛋白本身具有很低的抗微生物活性。因此，需要鉴定和利用抗微生物活性比现有技术中的更高的抗微生物蛋白。 专利技术简述本专利技术的目的是筛选和鉴定新的抗微生物蛋白，浓度甚至相对较低的该蛋白质也能抑制多种植物致病性微生物的生长，所述微生物包括Pyriculariaoryzae和茄属丝核菌，它们能导致影响水稻的两种主要疾病。 本专利技术的另一方面是克隆编码所述新蛋白质的基因并测定其碱基序列。 本专利技术的另一方面是将本专利技术的基因导入宿主生物(微生物，动物，植物等)以构建转化体，从而使用本专利技术的基因。 本专利技术的另一方面是提供抗微生物剂，其含有本专利技术的抗微生物蛋白。 附图简述图1显示了通过使用MonoQ柱分离的Lyophyllum shimeji蛋白质图与其抗微生物活性之间的关系。 图2显示了通过MonoQ柱分离的Lyophyllum shimeji蛋白质的电泳模式与其抗微生物活性之间的关系。泳道上方给出的数字分别对应于图1中的级分编号，而M表示分子量标记。泳道下方给出的符号(-，+，++，+++)表示抗微生物活性的强度。箭头表示抗微生物蛋白(70kDa和65kDa)。 专利技术详述深入研究上述问题的结果，本专利技术人建立了体外测定抗Pyricularia oryzae和茄属丝核菌的抗微生物活性的检测系统。完成此项任务之后，他们从食用蘑菇Lyophyllum shimeji中提取蛋白质。然后对提取出的蛋白质联合进行离子交换柱层析和高效液相层析(HPLC)，使用上述检测系统检查所得的每个级分。因此，专利技术人成功地鉴定，分离和纯化出抗微生物蛋白。另外，还测定了所纯化蛋白质的部分氨基酸序列。然后，使用在这些氨基酸序列的基础上合成的寡核苷酸作为引物进行RT-PCR，从而得到编码该蛋白质的部分长度的cDNA。随后，使用该部分长度的cDNA为探针，筛选源自Lyophyllumshimeji的cDNA文库。结果，分离出编码上述蛋白质的全长cDNA，并测定其完整的碱基序列。因此，本专利技术人成功地分离出源自Lyophyllum shimeji的新的抗微生物蛋白，并克隆出编码该蛋白质的DNA。另外，他们还测定了该蛋白质的氨基酸序列和DNA的碱基序列，从而完成了本专利技术。 因此，根据第一方面，本专利技术提供了抗微生物蛋白，可通过硫酸铵沉淀法沉淀Lyophyllum shimeji获得含水提取物级分来获得该蛋白质，已证实该蛋白质具有至少抗茄属丝核菌或Pyricularia oryzae的抗微生物活性，经SDS-PAGE法测定，该蛋白质前体型的分子量约为70kDa，成熟型的分子量约为65kDa。 通常，本专利技术的抗微生物蛋白具有序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。据推测，约为65kDa的成熟型蛋白质由SEQ ID NO1的氨基酸残基76至618组成，但本专利技术并不局限于此。 本专利技术的抗微生物蛋白不仅包括具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的抗微生物蛋白，也包括具有对SEQ ID NO2进行一个或多个氨基酸突变所得的氨基酸序列，或与SEQ ID NO2具有50％或更高同源性的氨基酸序列，并且显示出抗茄属丝核菌或pyricularia oryzae的抗微生物活性的抗微生物蛋白。 优选本专利技术的抗微生物蛋白与序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列具有60％或更高，优选为70％或更高，优选为80％或更高，特别优选为90％或更高，最优选为95％或更高的同源性。 根据第二方面，本专利技术提供了抗微生物蛋白，其含有选自下列的单个多肽具有例如序列表中SEQ ID NO2中氨基酸残基76至618的部分氨基酸序列的多肽；具有对SEQ ID NO2进行一个或多个氨基酸突变所得的氨基酸序列的多肽；或具有与SEQ ID NO2具有50％或更高同源性的氨基酸序列，并且显示出抗茄属丝核菌或pyricularia oryzae的抗微生物活性的多肽；或这些多肽的组合。 关于上述根据本专利技术第二方面的抗微生物蛋白，与每个特定的氨基酸序列“具有50％或更高同源性的蛋白质”的定义指的是只要至少具有50％同源性即是可接受的。然而，希望该蛋白质具有的氨基酸序列优选具有60％或更高，优选为70％或更高，优选为80％或更高，特别优选为90％或更高，最优选为95％或更高的同源性。 根据第三方面，本专利技术提供了产生本专利技术的抗微生物蛋白的方法，所述方法包括下列本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗微生物蛋白，可通过硫酸铵沉淀法沉淀Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｈｉｍｅｊｉ获得含水提取物级分来获得该蛋白质，其中所述蛋白质具有至少抗茄属丝核菌或Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ的抗微生物活性，并在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法中，显示出分子量约为７０ｋＤａ和／或约为６５ｋＤａ的组分的存在。

【技术特征摘要】
JP 1999-9-21 267238/991.抗微生物蛋白，可通过硫酸铵沉淀法沉淀Lyophyllum shimeji获得含水提取物级分来获得该蛋白质，其中所述蛋白质具有至少抗茄属丝核菌或Pyricularia oryzae的抗微生物活性，并在SDS-PAGE法中，显示出分子量约为70kDa和/或约为65kDa的组分的存在。2.根据权利要求1的抗微生物蛋白，其中N-末端具有序列表中SEQ IDNO3的N-末端氨基酸序列Asn Ala Glu Glu Gly Thr Ala Val Pro Tyr Val ProGly Tyr His Lys Lys Asn Glu Ile Glu Phe Gln Lys Asp Ile Asp Arg Phe Val。3.抗微生物蛋白，其具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列，对SEQID NO2进行一个或多个氨基酸突变所得的氨基酸序列，或与所述序列具有50％或更高同源性，并且显示出抗茄属丝核菌或Pyricularia oryzae的抗微生物活性的氨基酸序列。4.根据权利要求3的抗微生物蛋白，其具有的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列具有60％或更高的同源性。5.根据权利要求3的抗微生物蛋白，其具有的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列具有70％或更高的同源性。6.根据权利要求3的抗微生物蛋白，其具有的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列具有80％或更高的同源性。7.根据权利要求3的抗微生物蛋白，其具有的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列具有90％或更高的同源性。8.根据权利要求3的抗微生物蛋白，其具有的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列具有95％或更高的同源性。9.抗微生物蛋白，其含有选自下列的单个多肽具有序列表中SEQ IDNO2的氨基酸序列中的氨基酸残基76至618的部分氨基酸序列的多肽；具有对SEQ ID NO2进行一个或多个氨基酸突变所得的氨基酸序列的多肽；或具有与SEQ ID NO2有50％或更高同源性的氨基酸序列，并且显示出抗茄属丝核菌或Pyricularia oryzae的抗微生物活性的多肽；或这些多肽的组合。10.产生根据权利要求1，3或9的抗微生物蛋白的方法，所述方法包括下列步骤回收通过硫酸铵沉淀法，用75％-饱和硫酸铵沉淀的Lyophyllum shimeji含水提取物级分；和对所述级分进行离子交换层析并回收用0.05M至1M的NaCl洗脱的级分。11.编码根据权利要求1，3或9的抗微...

【专利技术属性】
技术研发人员：高仓由光，桑田茂，井上康宏，
申请(专利权)人：日本烟草产业株式会社，社团法人农林水产先端技术产业振兴中心，
类型：发明
国别省市：JP[日本]