野山参与栽培参非细胞DNA克隆鉴定方法技术

本发明专利技术涉及野山参与栽培参的鉴定方法。本发明专利技术依据野山参与栽培参的ＤＮＡ特征，采用随机扩增多态ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）方法，提供了一种准确、灵敏、方便的野山参与栽培参鉴定方法。本发明专利技术的非细胞ＤＮＡ克隆鉴定方法包括ＤＮＡ提取、ＤＮＡ纯化、ＤＮＡ扩增、电泳分析和结果判断等步骤。本发明专利技术的鉴定方法对人参的鉴别具有很大的社会和经济价值。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及植物的鉴定方法，具体涉及野山参与栽培参的鉴定方法。野山参是一种名贵的滋补品，随着近年来野山参资源的日益减少，其价格也不断上涨，致使许多不法之徒用移山参、栽培参等冒充野山参以谋取暴利，造成了市场混乱，损害了消费者的利益。野山参与栽培参的鉴定，从目前国内外的研究情况看，主要采用外部观察法及显微鉴定法。其主要依据的是野山参与栽培参的外部形态特征即所谓的性状特征、气味及内部细胞组织结构特征。这些方法在以往的野山参与栽培参的鉴定过程中，也起到过很大的作用。不过，这些方法有赖于人们对野山参与栽培参长期鉴定的经验结果，具有较多的主观性。尤其是当人参碾成粉末后，其外部特征和性状特征均已消失，很难区分哪个是野山参，哪个是栽培参。本专利技术的目的是要依据野山参与栽培参的DNA特征，采用随机扩增多态DNA(RAPD)方法，提供一种准确、灵敏、方便的鉴定方法。本专利技术公开的非细胞DNA克隆鉴定野山参与栽培参的方法是由下列步骤实现的1、DNA的提取分别取已知的野山参根、栽培参根和待测样品参根0.1～0.5g，研磨成细粉，移入离心管，加入CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)抽提缓冲液，及等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，离心；将上清液吸入离心管，加入异丙醇混匀后放入-20℃冰箱保存，再次离心；去上清液，沉淀加入TE缓冲液(1mmol/L Tris，0.1mmol/LEDTA，pH8.0)溶解，加1～2倍体积的无水乙醇混匀，冰箱放置；取出后，离心，去上清液，沉淀用乙醇洗涤，自然阴干；加无菌水溶解，吸取部分DNA溶液稀释备用。2、DNA提取液的纯化分别将已知野山参、栽培参和待测样品的DNA提取液离心，沉淀溶解于TE缓冲液中，加入2/3体积的乙醇再沉淀、离心，取沉淀物备用。3、DNA的扩增分别取上述纯化后的野山参、栽培参及样品的DNA提取物进行DNA扩增(1)反应的总体积为25μl。各反应成分的浓度分别为Mg2+浓度1.0～4.0mM、dNTP浓度0.1～0.4μM，引物浓度0.4～3.2μM，纯化后的DNA提取物浓度为稀释10～20倍，Taq酶浓度0.5～2.0unit。(2)用全自动PCR(多聚酶链式反应)仪进行DNA扩增，反应程序为①92～94℃变性3～5分钟35～37℃复性1～2分钟70～74℃延伸2～3分钟，1个循环②92～94℃变性1～2分钟35～37℃复性1～2分钟70～74℃延伸2～3分钟，40个循环③72℃延伸10分钟，1个循环4、电泳测定将上述经PCR扩增得到的野山参、栽培参和样品的DNA扩增产物进行电泳测定，电泳的材料为含0.05％EB(溴化乙锭)的1.5％～2％琼脂糖凝胶，电泳的缓冲液为1×TAE，电泳时的电压为100伏，电泳的时间为45分钟左右。在电泳时加λDNA/EcoRI+HindIIImarker做为分子量标记。5、结果分析电泳后，在紫外灯下观察拍照，将样品的电泳图与野山参、栽培参电泳图对照，进行判别，如样品具有野山参相应条带则样品为野山参，如无野山参相应条带，与栽培参条带相似则为栽培参。本专利技术野山参与栽培参的鉴定方法主要是利用了野山参与栽培参的遗传物质DNA的差异性来实现的。RAPD扩增技术已广泛用于生物的遗传育种、微生物、昆虫、蛇类等的鉴别，但至今未见应用于野山参与栽培参的鉴定，因为对不同的生物物种，其鉴别的各种技术条件相差很大。本专利技术野山参与栽培参非细胞DNA克隆鉴定方法，关键的第一步是提取获得较纯的DNA模板，模板DNA的好坏将直接影响最后的鉴定结果。本专利技术的DNA提取与纯化方法经反复筛选，能保证较高的DNA模板纯度，使测定结果清晰、稳定。干燥的野山参与栽培参易被空气氧化产生褐变，从而影响DNA的提取，为防止这一现象可在干燥野山参与栽培参的DNA抽提缓冲液中加入巯基乙醇等还原剂；另外在抽提液中还可加入十二烷基吡咯烷酮，以保护DNA不受破坏。本专利技术野山参与栽培参另一关键技术是DNA扩增引物的筛选，中药材基因组DNA由于采收、加工方式和贮存时间等不同，其降解程度差别较大，本专利技术方法采用合适的引物，使模板DNA在小分子片段有优势地扩增，扩增出200～1500bp条带的引物，分别得到基本一致的DNA指纹图谱，使野山参与栽培参扩增出具有各自特征的条带，从而达到区分和鉴定的目的。本专利技术采用的DNA扩增引物可以是S3CATCCCCCTGS4GGACTGGAGTS5TGCGCCCTTCS6TGCTCTGCCCS9TGGGGGACTCS10CTGCTGGGACS18CCACAGCAGTS20GGACCCTTACS22TGCCGAGCTGS45TGAGCGGACAOPH3AGACGTCCACOPH4GGAAGTCGCCOPH5AGTCGTCCCCOPH10CCTACGTCAGOPH11CTTCCGCAGTOPH12ACGCGCATGTOPH15AATGGCGCAGOPH16TCTCAGATGGOPH17CACTCTCCTCOPH20GGGAGACATC本专利技术利用人参中相对稳定的DNA，采用分子生物学RAPD扩增技术，建立了一种科学、灵敏、简捷、重现性好的野山参与栽培参鉴定方法，对规范人参市场，维护消费者的合法利益具有重大的社会效益和经济效益。实施例1、1、实验材料a.野山参由上海市药材有限公司神象参茸分公司提供，产地为吉林长白山；b.栽培参由上海市药材有限公司神象参茸分公司提供，产地为吉林不同区域；c.待测样品2、实验试剂和药品a.所有化学试剂均为分析纯，包括36％HCL Trisβ-巯基乙醇 氯仿异戊醇EDTA无水乙醇b.双蒸无菌水c.琼脂糖、λDNA/EcoRI+Hind III marker、MgCl2d.Taq酶、dNTP、引物S6购自Sangon公司3、实验仪器PCR仪比利时Equibio公司生产，Thermojet型电泳仪北京六一仪器厂生产DYY-III4离心机上海安亭科学仪器厂生产TGL-16C紫外灯上海顾村电光仪器厂生产三用紫外线分析仪4、实验步骤分别取野山参、栽培参与待测样品按下列步骤操作(1)DNA抽提a.取干燥参根研磨成细粉。b.称取0.1克至干净灭菌后的1.5ml离心泵，加入600μl左右预热到60℃的1×CTAB抽提缓冲液，摇匀，放入60℃水浴中温浴1小时，摇晃。c.取出后冷却到室温，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提蛋白，摇匀后至离心机中离心，离心速度为8000转/分，离心约10分钟。d.吸取上清液至另一干净、无菌后的1.5ml离心管，加入2/3体积的异丙醇(-20℃预冷)，摇匀后放入-20℃冰箱保存20分钟，离心(9000转/分)约10分钟。e.吸去上清液，加400μl左右的TE缓冲液溶解，再加入2倍体积的无水乙醇，摇匀。放入-20℃冰箱约2小时，取出后离心(10000转/分)约10分钟，去上清液，再用75％乙醇洗涤两次，自然阴干，加100μl无菌水溶解。f.吸取部分DNA溶液，稀释10倍，其余放入-20℃冰箱长期保存。(2)DNA提取液纯化将上述DNA溶液离心后，沉淀溶于TE缓冲液溶解后加入2/3体积乙醇再沉淀，离心，沉淀物备用。(3)DNA扩增a.反应总体积为2.5μlb.各成分用量如下3μl mM MgCl21μl0.2mM dNTP0.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种野山参与栽培参非细胞ＤＮＡ克隆鉴定方法，其特征在于该鉴定方法包括下列步骤：（１）ＤＮＡ的提取分别取已知的野山参根、栽培参根和待测样品参根０．１～０．５ｇ，研磨成细粉，移入离心管，加入ＣＴＡＢ抽提缓冲液，及等体积的氯仿∶异戊醇＝２ ４∶１抽提，离心；将上清液吸入离心管，加入异丙醇混匀后放入－２０℃冰箱保存，再次离心；去上清液，沉淀加入ＴＥ缓冲液溶解，加１～２倍体积的无水乙醇混匀，冰箱放置；取出后，离心，去上清液，沉淀用乙醇洗涤，自然阴干；加无菌水溶解，吸取部分ＤＮＡ溶液稀释备用；（２）ＤＮＡ提取液的纯化分别将已知野山参、栽培参和待测样品的ＤＮＡ提取液离心，沉淀溶解于ＴＥ缓冲液中，加入２／３体积的乙醇再沉淀、离心，取沉淀物备用；（３）ＤＮＡ的扩增分别取上述纯化后的野山参、栽培参及样品的ＤＮ Ａ提取物进行ＤＮＡ扩增：ａ．反应的总体积为２５μｌ。各反应成分的浓度分别为Ｍｇ↑［２＋］浓度１．０～４．０ｍＭ、ｄＮＴＰ浓度０．１～０．４μＭ，引物浓度０．４～３．２μＭ，纯化后的ＤＮＡ提取物浓度为稀释１０～２０倍，Ｔａｑ酶浓度０．５～ ２．０ｕｎｉｔ；ｂ．用全自动ＰＣＲ仪进行ＤＮＡ扩增，反应程序为：①９２～９４℃ 变性３～５分钟３５～３７℃ 复性１～２分钟７０～７４℃ 延伸２～３分钟，１个循环②９２～９４℃ 变性１～２分钟３５～３７℃ 复性１～２分 钟７０～７４℃ 延伸２～３分钟，４０个循环③７２℃延伸１０分钟，１个循环（４）电泳测定将上述经ＰＣＲ扩增得到的野山参、栽培参和样品的ＤＮＡ扩增产物进行电泳测定，电泳的材料为含０．０５％ＥＢ的１．５％～２％琼脂糖凝胶，电泳的缓 冲液为１×ＴＡＥ，电泳时的电压为１００伏，电泳的时间为４５分钟左右。在电泳时加λＤＮＡ／ＥｃｏＲⅠ＋ＨｉｎｄⅢ ｍａｒｋｅｒ 做为分子量标记；（５）结果分析电泳后，在紫外灯下观察拍照，将样品的电泳图与野山参、栽培参电泳图对照，进行判 别，如样品具有野山参相应条带则样品为野山参，如无野山参相应条带，与栽培参条带相似则为栽培参。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：万树文，丁建弥，梅其春，
申请(专利权)人：上海市药材有限公司神象参茸分公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]