猪单精子微卫星DNA标记分型方法技术

本发明专利技术属于猪微卫星ＤＮＡ标记分型技术领域，具体涉及猪的单精子微卫星ＤＮＡ标记分型的方法。其特点是，以琼脂糖电泳法分离猪的单个精子，采用多重ＰＣＲ和银染法进行实验，设计了内嵌引物以提高扩增的准确性，建立一套适合于猪单精子多个微卫星位点单倍型检测的方法，本发明专利技术可用于猪高精度遗传作图和性别鉴定。与已有技术相比，本发明专利技术简便、快速而且安全性好。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物微卫星DNA标记分型
，具体涉及猪的单精子DNA标记分型
鉴别单个精子中的基因型，对于性别鉴定和控制，遗传疾病的诊断，高精度遗传作图等方面均具有重要的应用价值。但由于技术难度大，除了人类中有少量报道外，家畜中的报道仅限于牛。Lewin等(1992，Genomics，1344-48)研究了牛23号染色体上淋巴细胞抗原(BoLA)DRB3基因与促乳素(PRL)基因间的重组率，他们分析了一个双杂合子牛的300个精子，最大似然法的估计结果为0.04，二者的紧密连锁说明可选择到同时含抗病力强且产奶量高的等位基因个体；Lie等(1993，Anim.Biotech，533-45)分析了3个酪蛋白(CASAS1、CASB、CASK)基因之间的遗传图距并作了排序，他们分析了一个三杂合子牛的330个精子，发现CASAS1与CASB、CASAS1与CASK间的重组率均为0.0075。且研究的均为功能基因。单配子中的微卫星DNA分型的报道3篇仅限于人类(Crouau-Roy等，1992，Mol.and Cell Bio.，3239-242；Hubert等，1992，Am.J. Hum.Genet.，51985-991；Furlong等，1993，Am.J.Hum.Genet.，521191-1199)，且都依赖于价值昂贵的流式细胞分离仪进行单精子的分离工作，均是基于同位素扩增，通过放射自显影辨别单精子单倍型，且需时长，不安全。猪中尚未建立单精子分型技术。目前已发表的单精子分型技术用于微卫星研究的三篇报道仅限于人遗传作图(Crouau-Roy等，1992；Hubert等，1992；Furlong等，1993)，而且所采用的方法均为两轮PCR，并在第二轮中加入同位素扩增，放射自显影鉴别等位基因，该法需时长且不安全。本专利技术的目的在于克服已有技术的不足，建立一种猪单精子微卫星DNA标记分型方法，以达到简便、快速、安全和经济有效的鉴别猪单精子基因型的效果。本专利技术通过以下技术方案实现一种猪微卫星DNA标记分型方法，含有猪微卫星位点引物，其步骤包括PCR(聚合酶链式反应，下同)和等位基因检测，其特征在于，对每个位点设计一个半嵌套引物，所述的步骤包括收集猪精液，分离单精子，选择检测位点，引物及内嵌引物的设计，单精子裂解，PCR扩增，等位基因检测，所述的PCR为三轮，按照以下步骤操作1)采用琼脂糖电泳法分离猪的单个精子，在小离心管中直接裂解2)第一轮PCR使步骤1)所述的单精子DNA拷贝数大量增加，使其适合于对多个位点的检测和分型；3)第二轮PCR对所涉及的特定目的位点进行扩增，获得大量目的微卫星DNA片段；4)第三轮PCR采用所述的内嵌引物，对目的位点的基因型进行分型；5)采用聚丙酰胺凝胶电泳和银染方法对步骤4)所述的基因型进行分析和鉴别。本专利技术采取以下步骤分离单精子取洗涤后的精液2μl悬浮于1ml PBS中，再从中取2μl加入到20ml 0.7％低溶点琼脂糖溶液中，混匀后铺于玻片上，37℃烘烤1h后，在倒置显微镜下，将只含有单个精子的琼脂糖碎片挑起，放入0.2ml Ep管中备用。本专利技术采取以下步骤对单精子进行裂解向每个含有单个精子的反应管中加入5μl单精子裂解液，覆盖矿物油后，65℃保温30min；再加入5μl单精子中和液，离心，混匀后，-20℃保存备用。本专利技术采取以下步骤对单个精子进行PCR扩增1)所述的PEP反应体系为500μl 10×不含K+的Buffer；含15个碱基的500μl 400mM随机引物，250μl 2mM 4种dNTP混合液，100μl 5U/μl Taq DNA聚合酶，补H2O至4.0ml，将上述混合液用于100个反应之用；2)向每个已裂解的单精子Ep管中加入40μl PEP反应液，混匀，覆盖矿物油后放入PCR仪中扩增，扩增条件为95℃，5min→50×(37℃，2min→55℃，4min→92℃，1min)→72℃，5 min。其中从37℃→55℃的升温速度为10S/℃，扩增完毕后，4℃保存备用；3)两轮PCR扩增步骤为第一轮PCR，其反应体系为500μl 10×PCRBuffer，250μl 2mM dNTP，10μl 100μM正向引物，10μl 100μM反向引物，20μl 5U/μl Taq DNA聚合酶，加H2O至4.5ml，将上述混合液以每管45μl分装至100个0.2ml Ep管中，然后加5μl单精子PEP产物，覆盖矿物油，放入PCR仪中扩增，扩增条件为96℃，5min→10×(94℃，1min→60℃，4min)→15×(94℃，1min→60℃，3min)→72℃，5min→扩增产物4℃保存备用；第二轮PCR其反应体系500μl 10×PCR Buffer，250μl 2mM 4种dNTP的混合液，45μl 100μM正向或反向引物，45μl 100μM内嵌引物，20μl 5U/μl TaqDNA聚合酶，加水至4.8ml将上述混合液以每管48μl分装至100个反应管中，每管加入2μl第一轮反应产物，覆盖矿物油后扩增，反应条件为95℃，5min→23×(94℃，1min→60℃，1min)→72℃，5min。以下结合附图和实施例对本专利技术作进一步描述附附图说明图1，是本专利技术内嵌引物的设计示意图，图中(GT)n为微卫星DNA序列，P1，P2为第一轮PCR所用引物，P3为本专利技术设计的内嵌引物。本专利技术设计出的内嵌引物序列见表1。每个位点中标号为3的引物即为本专利技术的半嵌套引物。实施例11、精液的制备共检测了6头公猪的精液，这些品种分别是“长白猪”3头，“清平猪”1头，“湖北白猪3系”1头和“大约克”1头。2、引物设计以猪12号染色体上4个猪微卫星位点(Sw1553、Sw1350、Sw874、Sw957)的引物序列(Rohrer等，1994a，Genetics，136231-245；1996，Genome Res.，6371-392)，见表1。用于内嵌引物设计的全序列由美国农业部肉畜研究中心Gary A.Rohrer博士通讯提供，顺序如下(5′-3′)Sw1553CCTTAACCCACTGAGCCACAAGAGAATTCCAGTATTATGCCTTTTAAAATTTTATGTGTTTTTAAAAATATCCCTCACTTGTTTTCCTCCAAATTATATGAATTTGGGGATATATAATAATACAAATTAATGTTGTAACAAGTAATGATAAAACAAAGTGAACCCCATAAAGTGTGAATAAGAATAAAGCTAGTCATTCTACTCCTCACAAGTAACCAGTGTTGGAAGCCTGGTGCGTTTTTCCATACCTTTCTCTCTGCTTTTACAAACATATACACACACATACACAGAGATTTTATTTGTTATTATTACCTGCATATGCATATGTATACATATATGTGTGTGTGTGAGTATGTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATAACTTTACAGCCAATTTGCTTTTAGGAGCTGGTCAAAGGATCASw1350GGAACATGCTTTGAGATTGTAAACACA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪微卫星ＤＮＡ标记分型方法，含有猪微卫星位点引物，其步骤包括ＰＣＲ和等位基因检测，其特征在于，对每个位点设计一个半嵌套引物，所述的步骤包括收集猪精液，分离单精子，选择检测位点，引物及内嵌引物的设计，单精子裂解，ＰＣＲ扩增，所述的ＰＣＲ为三轮，按照以下步骤操作：１）采用琼脂糖电泳法分离猪的单个精子，在小离心管中直接裂解：２）第一轮ＰＣＲ使步骤１）所述的单精子ＤＮＡ拷贝数大量增加，使其适合于对多个位点的检测和分型；３）第二轮ＰＣＲ对所涉及的特定目的位点进行扩增，获 得大量目的微卫星ＤＮＡ片段；４）第三轮ＰＣＲ采用所述的内嵌引物，对目的位点的基因型进行分型；５）采用聚丙酰胺凝胶电泳和银染方法对步骤４）所述的基因型进行分析和鉴别。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李奎，赵书红，彭中镇，余梅，刘榜，熊统安，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]