丙型肝炎病毒HCV5’非编码区基因分型的生物芯片制造技术

本发明专利技术公开了一种丙型肝炎病毒ＨＣＶ５’非编码区基因分型的生物芯片。它是在玻片、硅片、膜和高分子材料上固定我们设计的２８种特异ＤＮＡ探针，可用来检测丙型肝炎病毒及其３０多种亚型。本发明专利技术与现有技术相比，可以方便，快速地一次检测３０种左右的丙型肝炎病毒的亚型，非常适合于临床的病毒基因分型。每一种病毒亚型有一种杂交信号模式，分辨率高，专一性强。一次测试能检测的病毒亚型数是现有技术中最多的。采用荧光分析方法，灵敏度高。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种丙型肝炎病毒HCV5’非编码区基因分型的生物芯片。丙型肝炎病毒HCV是9，600个核苷酸的单链RNA病毒。含有一个编码3011氨基酸的ORF和5’非编码区(5’-Non-coding region)，3’非编码区。HCV病毒现在发现有十大类型(HCV type1，2，3，4，5，6，7，8，9，10)；每一大类型又有许多亚型(subtypes)，如HCV1a，HCV2b等。在临床上不同的亚型对于α-IFN的治疗，肝病的发生过程及严重程度有重要意义。HCV不同基因型也影响HCV感染的抗体诊断及病毒传染途径。α-IFN是治疗HCV感染最有效的方法之一，有关研究发现，HCV不同的亚型对α-IFN有不同的治疗效果，如HCV 1a，1b，2a，3a的治疗LTR(long-term response)分别为20％，7％，17％和16％。RIBAVIRIN是治疗慢性HCV肝炎的药物，经常与α-IFN同时使用，相关研究结果是HCV 1b，2a，3a的LTR分别是20％，40％和75％。另外，HCV 1b和4比HCV 1a，2a，3a感染在手术移植后，更快出现慢性肝病和cirrhosis并发症；而HCV 1b感染也更容易导致严重的慢性肝炎，cirrhosis和HCC(hepatocellular careinoma)形成。人类在疾病基因诊断(又称分子诊断)上的早期实践始于70年代初期，但直到80年代中期PCR(polymerase chain reaction)技术诞生后，其在医学诊断上的应用才得到了迅速的发展。现代基因诊断是应用分子生物学高新技术-如PCR、分子杂交和DNA测序等技术手段，通过在分子水平上对被检样品进行分析来达到诊断疾病的目的。目前人类对人体基因及病源体基因致病性的知识积累，己使基因诊断技术广泛应用于人类遗传病、传染病、肿瘤和其他与基因相关的许多疾病等方面的诊断。与医学上传统的实验诊断比较，基因诊断技术的主要优势是能获得高度特异性的针对病因分子的诊断结果，而对于人类遗传病，细菌，病毒感染和某些肿瘤病而言，基因诊断结果是最后的确诊指标。简变快速可靠的现代基因诊断新技术的发展，特别是最近生物芯片(biochip)技术的出现，其发展趋势将不可避免的替代现有临床实验室的许多方法，并可能改变传统的医学诊断观念。现在HCV的亚型分析一般是分析5’非编码区(5’NCR)，核心(core)区序列和NS5B序列。利用的方法主要有(1)PCR-RFLP(restriction fragment lengthpolymorphism)，该方法利用多种限制性内切酶对基因扩增产物进行酶切，不同的基因序列将产生不同的电泳图谱(Davidson F et al，J Gen Virol 1995，76，1197-1204；Murphy D et al，J Infect Dis，1994，169，473-475；Mellor Jet al，J Gen Virol，1995，76，2493-2507)，该方法只能应用于当突变改变了某一酶切位点时。(2)探针杂交方法(Stuyver J et al，Virus Res，1995，38，137-157；Tisminetzky SG et al，Int Hepatol Commun，1994，2，105-142)，待测基因经PCR扩增后，分别与15-20bp标记的特异性探针杂交。该方法需进行同位素标记或地高辛，生物素，过氧化物酶等标记，分析过程复杂，不适宜快速分析。(3)特异性PCR引物扩增方法(Okamoto H et al，J Gen Virol，1992，73，673-679；Okamoto H et al，J Gen Virol，1993，74，2385-2390)，其原理是根据已知突变位点的性质在引物中设计一错配碱基，使之仅能扩增突变型或野生型基因。该方法较为快速简便。但一次只能检测有限的亚型。(4)DNA酶免疫分析方法(DNA enzyme immunoassay)(Viazov S et al，J Virol Methods，1994，48，81-91)。(5)DNA测序法，这是最直观，最准确的方法。但技术复杂价格昂贵，不能作为常规方法。(6)ELISA分析法(Simmonds P et al，J ClinMicrobiol，1993，31，1493-503；Bhattacherjee V et al，J Gen Virol，1995，76，1737-48；Machida A et al，Hepatology，1992，16，886-91；Tanaka T etal，Hepatology，1994，19，1347-53)，这种方法只能对HCV病毒的主要类型(type)，如HCV1和HCV2，进行分类，不能分析亚型(subtype)。综上所述，在有关丙型肝炎病毒HCV的诊断及基因分型的现有技术中，存在操作繁杂，所需时间长，成本较高，难以自动化及大量样本平行分析等问题。本专利技术的目的就是针对现有技术的不足，提出一种与现有技术完全不同的有关HCV基因分型诊断方法。利用DNA芯片技术检测HCV病毒，并对30多种亚型进行分型。本专利技术的目的是提供一种可以方便，快速地一次检测30种左右的丙型肝炎病毒的亚型的丙型肝炎病毒HCV5’非编码区基因分型生物芯片。为了达到上述目的本专利技术采取下列措施丙型肝炎病毒HCV5’非编码区基因分型的生物芯片是在玻片、硅片、膜、高分子材料上固定诊断丙型肝炎病毒及其30多种亚型的DNA探针，所说的探针为HCV1(127-113) ATG CCT GGA GAT TTGHCV1(168-154) TTG CCA GGA CGA CCGHCV1a(242-228) GTG TCG TGC AGC CTCHCV1b(106-92) CCC CCG CGA GAC T/CGCHCV1c(145-131) CTT GGA TTA ACC CGCHCV1d(144-130) TTG GAT AAC CCC GCTHCV1f(143-129) TGG ATC TAA CCG CTCHCV2(139-125) TAA ACC CAC TCT ATGHCV2(83-69) TAG CGT TGG GTT GCGHCV2a(128-114) TAT GCC CGG TCA TTTHCV2b(168-154) TTA CCG GAA AGA CTGHCV2c(126-112) TGC CCG GCC ATT TGGHCV2d(129-115) CTA TGC CTG GTC ATTHCV2e(101-87) GCA AGA CCG CTA GCCHCV3(170-156) AAT CGC TGG GGT GACHCV3(129-114) CAA TAC CCA GAA ATT THCV3(103-89)CCG CGA GAT CAC TAGHCV3a(146-132) TCT TGG AGC AAC CCGHCV3d(145-132) CTT GGA ACA AAC CCGHCV3f(145-132) CT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丙型肝炎病毒ＨＣＶ５’非编码区基因分型的生物芯片，其特征在于在玻片、硅片、膜、高分子材料上固定检测丙型肝炎病毒及其３０多种亚型的ＤＮＡ探针，所说的探针为：ＨＣＶ１（１２７－１１３） ＡＴＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＡＴ ＴＴＧＨＣＶ１ （１６８－１５４） ＴＴＧ ＣＣＡ ＧＧＡ ＣＧＡ ＣＣＧＨＣＶ１ａ（２４２－２２８） ＧＴＧ ＴＣＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＴＣＨＣＶ１ｂ（１０６－９２） ＣＣＣ ＣＣＧ ＣＧＡ ＧＡＣ Ｔ／ＣＧＣＨＣＶ１ｃ（１４５－１３１） Ｃ ＴＴ ＧＧＡ ＴＴＡ ＡＣＣ ＣＧＣＨＣＶ１ｄ（１４４－１３０） ＴＴＧ ＧＡＴ ＡＡＣ ＣＣＣ ＧＣＴＨＣＶ１ｆ（１４３－１２９） ＴＧＧ ＡＴＣ ＴＡＡ ＣＣＧ ＣＴＣＨＣＶ２（１３９－１２５） ＴＡＡ ＡＣＣ ＣＡＣ ＴＣ Ｔ ＡＴＧＨＣＶ２（８３－６９） ＴＡＧ ＣＧＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＣＧＨＣＶ２ａ（１２８－１１４） ＴＡＴ ＧＣＣ ＣＧＧ ＴＣＡ ＴＴＴＨＣＶ２ｂ（１６８－１５４） ＴＴＡ ＣＣＧ ＧＡＡ ＡＧＡ ＣＴＧＨＣＶ２ｃ（１２ ６－１１２） ＴＧＣ ＣＣＧ ＧＣＣ ＡＴＴ ＴＧＧＨＣＶ２ｄ（１２９－１１５） ＣＴＡ ＴＧＣ ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＴＴＨＣＶ２ｅ（１０１－８７） ＧＣＡ ＡＧＡ ＣＣＧ ＣＴＡ ＧＣＣＨＣＶ３（１７０－１５６） ＡＡＴ ＣＧＣ ＴＧＧ ＧＧＴ ＧＡＣＨＣＶ３（１２９－１１４） ＣＡＡ ＴＡＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＴＴ ＴＨＣＶ３（１０３－８９） ＣＣＧ ＣＧＡ ＧＡＴ ＣＡＣ ＴＡＧＨＣＶ３ａ（１４６－１３２） ＴＣＴ ＴＧＧ ＡＧＣ ＡＡＣ ＣＣＧ ＨＣＶ３ｄ（１４５－１３２） ＣＴＴ ＧＧＡ ＡＣＡ ＡＡＣ ＣＣＧＨＣＶ３ｆ（１４５－１３２） ＣＴＴ ＧＧＡ ＡＴＣ ＡＡＣ ＣＣＧＨＣＶ４（２４４－２２９） ＧＡＧ ＴＧＴ ＴＧＴ ＡＣＡ ＧＣＣ ＴＨＣＶ４（１７０－１ ５６） ＡＡＴ ＣＧＣ ＣＧＧ ＧＡＴ ＧＡＣＨＣＶ４ｂｇ（１２７－１１３） ＡＴＧ ＣＣＣ ＧＧＣ ＡＡＴ ＴＴＧＨＣＶ４ｅ（１４４－１２９） ＴＴＧ ＧＡＴ ＴＡＡ ＡＣＣ ＧＣＴ ＣＨＣＶ５ａ（２４３－２２９） ＡＧＴ Ｇ ＴＣ ＧＡＡ ＣＡＧ ＣＣＴＨＣＶ６ａｂ（１４７－１３６） ＴＴＣ ＣＡＴ ＴＧＧ ＡＴＣ ＡＡＡＨＣＶ６ａ（２４２－２２８）...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶邦策，
申请(专利权)人：浙江江南生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]