产生ω‑3脂肪酸的酶和方法技术

本发明专利技术涉及在重组细胞(例如酵母或植物细胞)中合成长链多不饱和脂肪酸(特别是二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸)的方法。本发明专利技术还提供产生长链多不饱和脂肪酸的重组细胞或植物。此外，本发明专利技术涉及一组新的酶，它们具有去饱和酶或延长酶活性，可用于合成长链多不饱和脂肪酸的方法。具体地，本发明专利技术提供具有新活性的ω3去饱和酶、Δ5延长酶和Δ6去饱和酶。本发明专利技术还提供用于以多种基因瞬时和/或稳定转化细胞(特别是植物细胞)的方法和DNA构建体。

Have Omega 3 fatty acids and enzymatic method

The invention relates to the synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids (especially twenty carbon five enoic acid, twenty-two carbon five enoic acid and twenty-two carbon six enoic acid) in recombinant cells (such as yeast or plant cells). The invention also provides recombinant cells or plants that produce long chain polyunsaturated fatty acids. In addition, the present invention relates to a new set of enzymes, which have a desaturase or extended enzyme activity and can be used for the synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids. In particular, the invention provides a new active Omega 3 desaturase, a delta 5 elongate enzyme, and a delta 6 desaturase. The invention also provides methods and DNA constructs for transient and / or stable transformation of cells (especially plant cells) with a variety of genes.

【技术实现步骤摘要】
产生ω-3脂肪酸的酶和方法本申请是申请日为2009年11月17日，申请号为200980154876.9，标题为“产生ω-3脂肪酸的酶和方法”的专利申请的分案申请。
本专利技术涉及在重组细胞(例如酵母或植物细胞)中合成长链多不饱和脂肪酸(特别是二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸)的方法。本专利技术还提供产生长链多不饱和脂肪酸的重组细胞或植物。此外，本专利技术涉及一组新的酶，它们具有去饱和酶或延长酶活性，可用于合成长链多不饱和脂肪酸的方法。具体地，本专利技术提供具有新活性的ω3去饱和酶、Δ5延长酶和Δ6去饱和酶。本专利技术还提供用于以多种基因瞬时和/或稳定转化细胞(特别是植物细胞)的方法和DNA构建体。
技术介绍
现在广泛认为ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA和VLC-PUFA)是关乎人和动物健康的重要化合物。可从膳食来源或通过转换亚油酸(LA,18:2ω6)或α-亚麻酸(ALA,18:3ω3)而获得这些脂肪酸，LA和ALA被认为是人类膳食中的必需脂肪酸。尽管人和许多其他脊椎动物能够将植物来源的LA或ALA转换为VLC-PUFA，但这种转换的速率很慢。此外，大多数现代社会的饮食不平衡，其中至少90％的多不饱和脂肪酸(PUFA)是ω6脂肪酸，而非理想的4:1或更低的ω6:ω3脂肪酸的比例(Trautwein,2001)。对于人类，VLC-PUFA例如二十碳五烯酸(EPA,20:5ω3)和二十二碳六烯酸(DHA,22:6ω3)的直接来源主要是来自鱼类或鱼油。因此，健康专家们推荐将含有高水平VLC-PUFA的鱼类常规纳入人类饮食。例如，来源于鱼类的VLC-PUFA油被越来越多地添加到食品和婴儿配方奶中。不过，鉴于全球和国家鱼业的下滑，需要找到这些有益健康的油类的替代来源。与动物不同，高等植物不能合成链长超过18个碳原子的多不饱和脂肪酸。具体地，农作物和园艺植物以及其他被子植物不具有合成长链ω3脂肪酸例如衍生自ALA的EPA、二十二碳五烯酸(DPA,22:5ω3)和DHA所需的酶。因此，植物生物技术的一个重要目的是通过遗传工程学方法改造出产生大量VLC-PUFA的农作物，由此提供这些化合物的替代来源。VLC-PUFA生物合成途径生物体(例如微藻类、苔藓和真菌)中VLC-PUFA的生物合成通常是一系列的依赖氧的去饱和作用和延长反应(图1)。这些生物体中产生EPA的最常见的途径包括Δ6-去饱和作用、Δ6-延长作用和Δ5-去饱和作用(称为Δ6-去饱和作用途径)，较不常见的途径则使用Δ9-延长作用、Δ8-去饱和作用和Δ5-去饱和作用(称为Δ9-去饱和作用途径)。这些连续的去饱和作用和延长反应可以从ω6脂肪酸底物LA开始，见图1左上部分(ω6)，或从ω3底物ALA开始，见图1右下部分(ω3)。如果起始的Δ6-去饱和作用在ω6底物LA上进行，该系类三种酶的VLC-PUFA产物会是ω6脂肪酸ARA。合成VLC-PUFA的生物体可利用ω3-去饱和酶将ω6脂肪酸转换为ω3脂肪酸，如图1所示的将花生四烯酸(ARA,20:4ω6)转换为EPA的Δ17-去饱和酶步骤。ω3-去饱和酶家族的一些成员可作用于从LA到ARA的大量底物。植物ω3-去饱和酶通常特异性催化由LA到ALA的Δ15-去饱和作用，而真菌和酵母ω3-去饱和酶对由ARA到EPA的Δ17-去饱和作用具有特异性(Pereira等，2004a；Zank等，2005)。一些报道提示可能存在非特异性的ω3-去饱和酶，可将多种ω6底物转换为相应的ω3产物(Zhang等，2007)。其他ω3-去饱和酶可对ω3底物具有偏向性(Sayanova等，2003)。在这些生物体中，EPA转换为DHA相对简单，包括通过Δ5-延长作用由EPA产生DPA，随后通过Δ4-去饱和作用产生DHA(图1)。相反，哺乳动物则利用所谓的“Sprecher”途径，通过不依赖于Δ4去饱和酶的3个分开的反应将DPA转换为DHA(Sprecher等，1995)。前端去饱和酶通常存在于植物、苔藓、微藻类和低等动物(例如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans))中，主要接受与磷酯酰胆碱(PC)底物的sn-2位置发生酯化的脂肪酸底物。这些去饱和酶因此称为酰基-PC脂质连接的前端去饱和酶(Domergue等，2003)。相反，高等动物前端去饱和酶通常接受酰基辅酶A底物，其中脂肪酸底物连接于CoA而非PC(Domergue等，2005)。PUFA和VLC-PUFA延长反应各自包括由多组分蛋白复合体催化的4个步骤：首先，缩合反应给脂肪酸加上来自丙二酰-CoA的2C单元，导致形成β-酮酰基中间体，然后通过NADPH将其还原，随后脱水产生烯醇基中间体，该中间体最后被再次还原，产生延长的脂肪酸。通常认为这4个反应中的缩合步骤具有底物特异性，而其他步骤则不具有。在实践中，这意味着，只要引入对VLC-PUFA具有特异性的缩合酶(典型地称为“延长酶”)，植物中的天然延长机制便能够延长VLC-PUFA，只不过植物中的天然延长机制延长非天然VLC-PUFA底物的效率可能是低的。2007年鉴定并表征了酵母延长作用循环脱水酶(DenicandWeissman,2007)。在植物、苔藓和微藻类中，VLC-PUFA去饱和作用天然发生在主要属于酰基-PC库的脂肪酸底物，而延长作用则发生在酰基-CoA库的底物。脂肪酸从酰基-PC分子转移至CoA载体是由磷脂酶类(PLA)进行的，而酰基-CoA脂肪酸转移至PC载体是由溶血卵磷脂酰基转移酶类(LPCAT)进行的(图2)(Singh等，2005)。在去饱和作用可以跟上延长作用之前必需发生酰基交换(反之亦然)，由此引起的流量下降可通过使用对酰基辅酶A底物具有特异性的去饱和酶而克服(Hoffmann等，2008)。遗传工程化产生VLC-PUFA绝大多数VLC-PUFA代谢工程一直采用需氧Δ6-去饱和作用/延长作用途径进行。1996年首次报道了使用来自蓝细菌集胞藻(Synechocystis)的Δ6-去饱和酶在烟草中生物合成γ-亚麻酸(GLA,18:3ω6)(ReddyandThomas,1996)。最近，已经在农作物例如向日葵(73％GLA；Knauf等，2006)和大豆(28％GLA；Sato等，2004)中产生GLA。由于涉及更多的去饱和作用和延长作用步骤，因此产生VLC-PUFA例如EPA和DHA涉及更复杂的工程化。Qi等(2004)最早报道了在陆生植物中产生EPA，其将编码来自球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)的Δ9-延长酶的基因、编码来自小眼虫(Euglenagracilis)的Δ8-去饱和酶的基因、和编码来自高山被孢霉(Mortierellaalpina)的Δ5-去饱和酶的基因引入拟南芥，产生高达3％的EPA。随后Abbadi等(2004)报道了使用编码来自小立碗藓(Physcomitrellapatens)的Δ6-去饱和酶和Δ6-延长酶的基因和编码来自三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的Δ5-去饱和酶的基因在亚麻子中产生了高达0.8％的EPA。WO04/017467首次报道了产生DHA，并迄今为止其报道的产生VLC-PUFA的水平是最高的本文档来自技高网...

【技术保护点】
从包含二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的种子提取油的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得欧洲油菜(Brassica napus)种子，所述种子包含编码微藻Δ6去饱和酶、Δ6延长酶、Δ5去饱和酶、微藻Δ5延长酶和Δ4去饱和酶的外源性多核苷酸，其中各多核苷酸与一或多个在种子发育期间指导所述多核苷酸表达的启动子可操作连接，以产生包含二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的种子，所述二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸在所述种子发育期间产生自α‑亚麻酸(ALA)，并且以酯化形式作为甘油三酯的部分以基于将α‑亚麻酸转换为二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸的效率是至少15.4％的水平存在，和(ii)从所述种子提取油。

【技术特征摘要】
2008.11.18 US 61/199,669;2009.07.09 US 61/270,7101.从包含二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的种子提取油的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得欧洲油菜(Brassicanapus)种子，所述种子包含编码微藻Δ6去饱和酶、Δ6延长酶、Δ5去饱和酶、微藻Δ5延长酶和Δ4去饱和酶的外源性多核苷酸，其中各多核苷酸与一或多个在种子发育期间指导所述多核苷酸表达的启动子可操作连接，以产生包含二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的种子，所述二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸在所述种子发育期间产生自α-亚麻酸(ALA)，并且以酯化形式作为甘油三酯的部分以基于将α-亚麻酸转换为二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸的效率是至少15.4％的水平存在，和(ii)从所述种子提取油。2.权利要求1的方法，其中所述二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸在所述种子发育期间产生自α-亚麻酸(ALA)，并且以酯化形式作为甘油三酯的部分以基于将α-亚麻酸转换为二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸的效率是至少17.3％的水平存在。3.权利要求1的方法，其中二十二碳五烯酸在所述种子发育期间产生自二十碳五烯酸，并且以酯化形式作为甘油三酯的部分以基于将二十碳五烯酸转换为二十二碳五烯酸的效率是至少60％的水平存在。4.权利要求1的方法，其中所述微藻Δ6去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ6去饱和酶活性高于对作为脂肪酸底物的连接于卵磷脂(PC)的sn-2位置的ALA的Δ6去饱和酶活性。5.权利要求1的方法，其中所述Δ5去饱和酶和/或Δ4去饱和酶是微藻Δ5去饱和酶和/或微藻Δ4去饱和酶。6.权利要求1的方法，其中二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸以基于将α-亚麻酸转换为二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸的效率是至少15.4％的水平存在。7.权利要求1的方法，其中二十二碳六烯酸以基于将α-亚麻酸转换为二十二碳六烯酸的效率是至少9.5％的水平存在。8.权利要求1的方法，其中二十二碳六烯酸以基于将二十碳五烯酸转换为二十二碳六烯酸的效率是至少45％的水平存在。9.权利要求1的方法，其中花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸总计包含种子内总脂肪酸的15％。10.权利要求1的方法，其中所述Δ6去饱和酶是Ostreococcustauri或细小微胞藻(Micromonaspusilla)Δ6-去饱和酶。11.生产包含酯化形式的二十二碳六烯酸(DHA)的脂质的方法，所述方法包括从植物细胞提取脂质的步骤，所述植物细胞包含编码以下酶的外源性多核苷酸：Δ6去饱和酶，Δ6延长酶，Δ5去饱和酶，Δ5延长酶，和Δ4去饱和酶，其中各外源性多核苷酸与指导所述多核苷酸在所述植物细胞中表达的启动子可操作连接，其中Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶和Δ4去饱和酶中多于一个是微藻去饱和酶，其中Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶和Δ4去饱和酶中的一或多个对酰基-CoA底物的活性高于对相应的酰基-卵磷脂(酰基-PC)底物的活性，并且其中DHA在所提取的脂质中的存在水平为所提取的脂质的总脂肪酸含量的3％至5％，从而产生包含DHA的脂质。12.权利要求11的方法，其中所述Δ6去饱和酶是微藻Δ6去饱和酶，其对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的活性高于对作为脂肪酸底物的连接于PC的sn-2位置的α-亚麻酸(ALA)的活性。13.权利要求11的方法，其中所述Δ6去饱和酶是OstreococcustauriΔ6去饱和酶。14.权利要求12的方法，其中所述微藻Δ6去饱和酶具有由SEQIDNO:30所示的氨基酸序列。15.权利要求11的方法，其中所述Δ5延长酶是微藻Δ5延长酶。16.权利要求11的方法，其中所述Δ5延长酶具有由登记号AAV67798所提供的氨基酸序列。17.权利要求11的方法，其中所述Δ4去饱和酶具有由登记号AY332747所提供的氨基酸序列。18.权利要求11的方法，其中各外源性多核苷酸与种子特异性启动子可操作连接。19.权利要求11的方法，其中总脂肪酸含量的4％是DPA。20.权利要求11的方法，其包括纯化所提取的脂质的步骤。21.生产包含酯化形式的二十二碳六烯酸(DHA)的脂质的方法，所述方法包括从植物细胞提取脂质的步骤，所述植物细胞包含编码以下酶的外源性多核苷酸：Δ6去饱和酶，Δ6延长酶，Δ5去饱和酶，Δ5延长酶，和Δ4去饱和酶，其中各外源性多核苷酸与指导所述多核苷酸在所述植物细胞中表达的启动子可操作连接，其中Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶和Δ4去饱和酶中的一或多个对酰基-CoA底物的活性高于对相应的酰基-卵磷脂(酰基-PC)底物的活性，其中Δ5去饱和酶和Δ4去饱和酶中的一或多个是微藻去饱和酶，其中所述Δ6去饱和酶是微藻Δ6去饱和酶，其对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的活性高于对作为脂肪酸底物的连接于PC的sn-2位置的α-亚麻酸(ALA)的活性，并且对ALA的Δ6去饱和酶活性高于对作为脂肪酸底物的亚油酸(LA)的Δ6去饱和酶活性，并且其中DHA在所提取的脂质中的存在水平为所提取的脂质的总脂肪酸含量的3％至5％，从而产生包含DHA的脂质。22.生产包含酯化形式的二十二碳六烯酸(DHA)的脂质的方法，所述方法包括从植物细胞提取脂质的步骤，所述植物细胞包含编码以下酶的外源性多核苷酸：Δ6去饱和酶，Δ6延长酶，Δ5去饱和酶，Δ5延长酶，和Δ4去饱和酶，其中各外源性多核苷酸与指导所述多核苷酸在所述植物细胞中表达的启动子可操作连接，其中Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶和Δ4去饱和酶中多于一个是微藻去饱和酶，其中Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶和Δ4去饱和酶中的一或多个对酰基-CoA底物的活性高于对相应的酰基-卵磷脂(酰基-PC)底物的活性，其中所述Δ4去饱和酶是来自路氏巴夫藻(Pavlovalutheri)或盐生巴夫藻(Pavlovasalina)的Δ4去饱和酶，并且其中DHA在所提取的脂质中的存在水平为所提取的脂质的总脂肪酸含量的3％至5％，从而产生包含DHA的脂质。23.从包含α-亚麻酸(ALA)的种子提取油的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得包含编码以下酶的外源性多核苷酸的欧洲油菜种子：氨基酸序列由SEQIDNO:30所示的Δ6去饱和酶，氨基酸序列由登记号AF489588所提供的Δ5去饱和酶，氨基酸序列由登记号AAV67798所提供的Δ5延长酶，和氨基酸序列由登记号AY332747所提供的Δ4去饱和酶，其中各外源性多核苷酸与指导所述多核苷酸在细胞中表达的启动子可操作连接，和(ii)从所述种子提取油。24.权利要求23的方法，其中Δ6延长酶具有由登记号AF428243所提供的氨基酸序列。25.权利要求23的方法，其中所述种子的总脂肪酸含量包含α-亚麻酸(ALA)、亚麻油酸(SDA)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，其中所述ALA、SDA、ETA、EPA、DPA和DHA各自存在于所述总脂肪酸含量中的水平以总脂肪酸含量的百分比表示，从而DPA和DH...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·R·皮特里，A·M·麦肯齐，柳青，P·什雷斯塔，P·D·尼科尔斯，S·I·E·布莱克本，M·P·曼苏尔，S·S·罗伯特，D·M·F·弗兰普顿，周雪荣，S·P·辛格，C·C·伍德，
申请(专利权)人：联邦科学技术研究组织，粮食研究发展公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚,AU