建立一种乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的探测系统的方法，其特征是： ａ、以ＨＢＶ ＤＮＡ为靶序列设计寡核苷酸探针，探针包含２１－６０个核苷酸，由两部分组成，其中主要部分长１５－５０个核苷酸，与ＨＢＶ ＤＮＡ的突变区或保守区互补；另外一小部分为６－１０个核苷酸Ｔ，将寡核苷酸的５’端或３’端进行烷烃硫醇修饰； ｂ、将烷烃硫醇修饰的探针通过Ａｕ－Ｓ键共价结合于Ａｕ纳米颗粒或Ｆｅ↓［３］Ｏ↓［４］核／Ａｕ壳纳米颗粒上； ｃ、采用磁场操控俘捉探针； ｄ、检测系统中加入连接链和信号放大物质。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒基因检测
具体地讲是利用Fe3O4(核)/金(壳)纳米颗粒乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)探针，通过二次放大技术，建立检测HBVDNA及其变异的方法。
技术介绍
纳米颗粒是直径为1-100nm的颗粒，在该尺度范围内，纳米材料有很多新的特性，因此它成为科学研究的热点领域。利用纳米材料独特的力、电、光、磁等特性，形成高度学科交叉的纳米生物医学技术，在现实中具有广泛的应用价值。1996年Chad A Mirkin等人将烷烃硫醇修饰的寡核苷酸通过金-硫(Au-S)键共价结合于金纳米颗粒的表面，形成以金纳米颗粒为标记的DNA探针，并利用此探针，检测靶DNA。他们发现当形成金纳米颗粒聚合体时，靶单链的检测下限可达到10fMol；当形成金纳米单层后加入Ag+对苯二酚液进行放大，靶单链的检测下限可达到50fMol。这一研究成果发表在《科学》上。病毒性肝炎(特别是乙型肝炎)是严重危害人类健康的重要疾病，据估计全世界HBV携带者有4-5亿。我国是HBV感染高发地区，HBV人群携带率为10-20％，每年由于病毒性肝炎给国家造成的直接经济损失约为500-1000亿元，由此产生的社会负担及其它负面影响更为巨大。乙肝患者(包括肝移植术前术后)经抗病毒治疗后野生型乙肝病毒滴度下降或发生变异(尤其在应用拉米呋啶治疗的患者)，采用传统的生化方法(ELISA，enzyme-linked immunoadsordent assay)不能检出，PCR(polymorase chainreaction)技术因存在一定假阳性有其应用局限性。HBV变异后可产生免疫逃逸、抗疫苗性及抗药性等，病情易恶化并严重威胁患者的生命。目前尚未有文献公开利用利用Fe3O4(核)/金(壳)纳米颗粒乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸探针，通过二次放大技术，检测HBV DNA及其变异的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是将DNA结合的特异性与纳米材料独有的特性很好地整合起来，建立了一种新型的DNA探测系统，实现HBV DNA及其变异的超灵敏探测。本专利技术是这样实现的a、以HBV DNA为靶序列设计寡核苷酸探针，探针包含21-60个核苷酸，由两部分组成，其中主要部分长15-50个核苷酸，另外一小部分为6-10个核苷酸，将寡核苷酸的5’端或3’端进行烷烃硫醇修饰；用化学方法合成寡核苷酸，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。寡核苷酸中主要部分是与HBVDNA的突变区或保守区互补的，长15-50个核苷酸；另外一小部分为6-10个核苷酸T，以保证寡核苷酸中的主要部分与其互补区充分结合。b、将烷烃硫醇修饰的探针通过Au-S键共阶结合于Au纳米颗粒或Fe3O4(核)/Au(壳)纳米颗粒上；c、采用操控俘捉探针；d、检测系统中加入连接链和信号放大物质。此专利技术的主要优点有三个1、信号二次放大效应，实现了HBV DNA的超灵敏探测。针对HBV DNA设计的金纳米颗粒DNA探针与靶单链在溶液中杂交，在此基础上设计连接链替代靶单链以形成金纳米颗粒聚合体，极大地减少靶单链的需用量(信号一次放大)；随后加入银(Ag+)-对苯二酚液，Ag+离子将从金纳米颗粒表面或溶液中夺得一个电子而还原为Ag原子，并附着于金纳米颗粒表面上(信号二次放大，放大约105倍)。两次放大可使DNA的检测下限小于0.1fMol(目前国际上可探测的敏感度为10fMol)，通过对聚合体灰度的分析，定性或半定量地检测出已知序列的HBV DNA片段，从而实现HBV DNA的超灵敏探测。同时，利用Au纳米颗粒的等离子共振信号在DNA变性温度范围极其敏感的特点寡核苷酸修饰的Au纳米颗粒体系的光吸收随温度变化的曲线在DNA变性温度附近的变化极陡锐，其一次微分的半峰宽Full Width atHalf Maximum(FWHM)～2℃，而通常DNA的FWHM～15℃，从而提高了DNA杂交的特异选择性。2、我们专利技术并应用Fe3O4(核)/Au(壳)纳米颗粒，极大地减小了杂交的位阻效应，以确保杂交率。传统的Au纳米颗粒无内核，我们所构建的HBVDNA的俘捉探针因含有Fe3O4内核，通过磁场加以控制，既可将靶单链从待检样品中预分离，又可借助磁场在基底上形成覆盖率可控的Fe3O4(核)/Au(壳)-Au纳米颗粒单层，从而极大地减小了杂交的位阻效应，确保HBV DNA样品中靶单链的检测下限达到0.1fMol。3、该技术的另一个显著的优点就是检测成本低。其主要耗材是烷烃硫醇-寡核苷酸修饰的金纳米颗粒。假设每个聚合体有近千个金纳米颗粒，每个金纳米颗粒(直径约15nm)连接约220条寡核苷酸(实际数可低30-50％)，若探测系统含有近千个聚合体，则共需寡核苷酸的数目约为2.2×108条。而购买烷烃硫醇修饰的寡核苷酸(20D值，HPLC纯化)的价格约为1100～1500元，其中含有约1×1016条寡核苷酸。而且金纳米颗粒的制备成本也很低。每次探测耗材(烷烃硫醇修饰的寡核苷酸、金纳米颗粒)的费用少于1元。如果该技术能实现集成自动化的仪器检测，将具有很大的利润空间和价格优势。附图说明附图Fe3O4(核)/金(壳)纳米颗粒HBV DNA探针检测过程示意图具体实施方式寡核苷酸的设计与合成寡核苷酸探针包含26个核苷酸，由两部分组成，其中主要部分是与HBV DNA的突变区或保守区互补的，长20个核苷酸；另外一小部分为6个核苷酸T，以保证寡核苷酸中的主要部分与其互补区充分结合。1、各型乙型肝炎HBV DNA(急性、慢性/重型、轻型及病毒携带者)变异株、野生株的筛选、克隆和纯化。找出与乙型肝炎病情发生发展相关的突变区并进行系统研究，针对常见突变的区域设计探针；同时设计HBV DNA保守序列区域的探针。以HBV DNA(accessionX75658)1873-1912位为靶序列设计探针①设计的探针c(probe c)与靶单链的1893-1912位互补，探针c序列为5’-ttt ttt gtc aat gtc cat gcc cca aa-3’。②连接链(linker)的设计连接链长40bp，序列为5’-caa gct gtg cct tgg gtg gcg ggg ggg ggg ggg ggg ggg g-3’前20bp与靶单链上未跟probe c杂交的部分(即1873-1892位)相同，后20bp不与probe c互补或相似。以linker替代靶单链形成金纳米颗粒聚合体，可大大减少了靶单链的需用量，达到超灵敏地探测DNA。③对连接链上的这两段分别设计出探针a(probe a)和探针b(probeb)，probe a序列为5’-gcc acc caa ggc aca gct tgt ttt tt-3’probe b序列为5’-ttt ttt ccc ccc ccc ccc ccc ccc cc-3’它们与连接链严格地互补。探针的设计结果是probe a和probe c可与靶单链上不同段互补结合，probe a和probe b可与linker上不同段互补结合。将烷烃硫醇修饰寡核苷酸的5’端或3’端。用化学方法合成寡核苷酸，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。2、将烷烃硫醇修饰的探针本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宁琴，姚凯伦，罗小平，刘祖黎，习东，卢强华，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。