用于HCV感染的组合物和方法技术

本发明专利技术提供包含在ＨＣＶ感染之后可有效产生ＨＣＶ的细胞的组合物、用于培养该细胞的组合物、制备该组合物的方法以及在该组合物的细胞中注射ＨＣＶ的方法。本发明专利技术也提供了分析ＨＣＶ产生的方法以及评价影响ＨＣＶ产生的化合物的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
虽然丙型肝炎病毒(HCV)在受感染的人体中强力复制，但是在培养细胞中生长病毒的有力方法尚不理想。使用感染性血清体内感染培养的人肝细胞时，只有少量HCV复制，只能由逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)检测到。对于外周血单核细胞、人B和T细胞系、人肝细胞系以及原发的人胎和成人细胞，利用HCV感染培养细胞的努力已有报道。然而，迄今报道的结果令人失望。病毒复制常常很少，以致于感染的细胞群体所产生的HCV即使存在，也只能通过RT-PCR检测到，因而只能观察到HCV RNA的少量拷贝。另外，相同的病毒和细胞在相同或不同时期的病毒产生具有偶发性，并且孔与孔之间不可重复。再有，给予病毒几天甚至一个月以后，才能观察到感染高峰，例如Iacovacci等人，Hepatology26(5)1328-1337(1997)。这些问题阻碍了可用于HCV患者治疗和/或HCV感染相关研究的化合物的鉴定和快速筛选。因此，需要在细胞培养物中感染和复制HCV的方法。也需要快速有效的方法，用于确定在培养中抑制HCV产生的化合物。本申请提供包含可以有效复制HCV的细胞的组合物、制备细胞组合物、培养细胞所用培养基的方法、利用HCV感染细胞的方法、分析HCV感染的方法、以及利用本专利技术组合物和方法评价化合物影响HCV产生能力的方法，从而解决了这些问题。专利技术概述本专利技术提供制备包含大量产生HCV的培养细胞的组合物的方法。本专利技术提供可以被HCV有效感染的组合物，其包含细胞混合物，其中含有来自妊娠之后三月龄或以上的人肝的细胞。本专利技术也提供包含利用本专利技术方法制备的细胞的组合物。在一个实施方案中，本专利技术的组合物包含含有表达甲胎蛋白的细胞、表达白蛋白的细胞、表达血型糖蛋白的细胞、但基本上不含表达CD34蛋白质的细胞的细胞混合物。在本专利技术另一实施方案中，细胞混合物中的细胞可以穿过约40微米大小的滤器。在本专利技术另一实施方案中，所述组合物与饲养细胞联用、或另外包含饲养细胞。在本专利技术又一实施方案中，所述饲养细胞是STO(Reid-99)细胞。本专利技术提供用于培养细胞的组合物。在本专利技术的一个实施方案中，该用于培养细胞的组合物包含含钙的无血清培养基、游离脂肪酸(FFA)、高密度脂蛋白(HDL)、烟酰胺、微量元素、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松。根据本专利技术另一实施方案，上述组合物不包含低密度脂蛋白。根据本专利技术另一实施方案，所述组合物另外包含下列成分的任何一种、组合、或全部胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子。本专利技术提供通过将HCV给予本专利技术的组合物从而感染细胞混合物的方法。根据本专利技术的一个实施方案，该HCV是RNA898。在本专利技术的另一实施方案中，首先将HCV病毒与组合物(接种物)在约0.52ml/cm2的体积中约37℃温育约24小时，然后洗涤组合物中的细胞或利用细胞培养基替换接种物。本专利技术提供分析HCV感染的方法将本专利技术的组合物与饲养细胞温育、将组合物中的细胞与HCV接触；并测定细胞和/或培养细胞的培养基相关联的HCV。另外，本专利技术提供评价化合物影响HCV产生能力(即影响细胞组合物产生更多HCV的能力)的方法，其包含将本专利技术的组合物与饲养细胞温育、将组合物中的细胞与HCV病毒接触、以及在接触HCV前后给予该化合物的步骤。在一个实施方案中，该方法用于筛选抑制HCV产生的细胞。在另一实施方案中，该方法用于同时筛选多种化合物抑制HCV产生的能力。在另一实施方案中，通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)测定HCV RNA的数量，从而确定HCV的存在。在一个实施方案中，将样品中的HCV RNA与用作内部对照的另一种病毒的RNA的量相比较。在另一实施方案中，所述另一种病毒是牛病毒性腹泻病毒(＂BVDV＂)。附图简述附图说明图1描述了利用RNA898(-□-)或无血清对照(-●-)感染以后，通过测定培养上清中存在的HCV RNA水平，对人胎肝细胞感染的时间过程分析。上清样品RT-PCR分析的定量极限值(----LOQ)是600个HCV RNA拷贝/样品。给出了三次重复培养物的平均HCV RNA/ml值及其标准差。图2描述了利用RNA898(-□-)或阴性对照血清(-×-)感染以后，通过测定培养上清中存在的HCV RNA水平，对人胎肝细胞感染的时间过程分析。阴性对照血清得自未患HCV感染的患者。上清样品RT-PCR分析的定量极限值(----LOQ)是600个HCV RNA拷贝/样品。给出了三次重复培养物的平均HCV RNA/ml值及其标准差。图3描述了利用RNA898(-□-)或阴性对照血清(-×-)感染以后，通过测定培养上清中存在的HCV RNA水平，对人胎肝细胞感染的时间过程分析。阴性对照血清来自未患HCV感染的患者。上清样品RT-PCR分析的定量极限值(----LOQ)是600个HCV RNA拷贝/样品。给出了三次重复培养物的平均HCV RNA/ml值及其标准差。图4描述了利用RNA898感染以后，通过测定细胞关联的HCVRNA水平，对人胎肝细胞感染的时间过程分析。阴性对照血清数据未显示。接种之后，在给予病毒1、2、3、6和8天后洗涤并收集培养物中的细胞。细胞关联的(cell-associated)RNA样品RT-PCR分析的定量极限值(----LOQ)是100个HCV RNA拷贝/样品。给出了三次重复培养物的平均HCV RNA/孔值及其标准差。图5描述了利用一定浓度范围内的抗病毒剂VRT-106866抑制人胎肝细胞的HCV感染。利用多重HCV特异性RT-PCR定量分析，测定样品中的HCV RNA。细胞关联的RNA样品RT-PCR分析的定量极限值是100个HCV RNA拷贝/样品。结果表示为三次重复培养物的＂对照HCV RNA％＂(样品值/阳性对照平均值)的平均值和标准差。专利技术详述本专利技术的组合物包含细胞混合物，其中包含从妊娠后三月龄或以上的人肝中释放的细胞。根据一个实施方案，所述人的年龄介于并包括妊娠后三个月直至出生后一年。在本专利技术另一实施方案中，所述人年龄为妊娠后三至六个月。在另一实施方案中，所述人年龄介于妊娠后18至22周。在本专利技术的一个实施方案中，所述细胞包含胎肝细胞和造血细胞。根据本专利技术的一个实施方案，所述肝细胞和造血细胞可以表达甲胎蛋白、白蛋白和/或血型糖蛋白。根据优选实施方案，如果所述人是成年人，则人的肝是健康的。根据另一实施方案，本专利技术的组合物包含表达甲胎蛋白的细胞、表达白蛋白的细胞、以及表达血型糖蛋白的细胞，但基本上不含表达CD34蛋白质的细胞。细胞混合物的细胞可用特异性针对甲胎蛋白、白蛋白或血型糖蛋白的抗体进行免疫染色，但是该细胞混合物基本上不含可用特异性针对CD34蛋白质的抗体进行免疫染色的细胞。根据本专利技术，术语＂基本上不含表达CD34蛋白质的细胞＂是指利用碱性磷酸酶染料检测系统(例如Harlow等人，AntibodiesA Laboratory Manual(1988)Cold Spring Harbor Laboratory，349，406-407页；DAKOCorporation的LSAB2试剂盒)检测免疫结合时，细胞混合物中的细胞显示很少或没有可观测的CD34抗体免疫染色。根据本专利技术组合物的一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含细胞混合物的组合物，其包含妊娠后三月龄或以上的人肝中释放的肝细胞和造血细胞，其中对于４×１０↑［５］细胞组成的细胞混合物，在给予ＨＣＶ病毒ＲＮＡ８９８（″ＲＮＡ８９８″，２００１年３月２７日保藏于美国典型培养物中心，１０８０１Ｕｎｉ ｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０－２２０９；ＡＴＣＣ保藏号：ＰＴＡ－３２３７）７２小时以后，该组合物连同饲养细胞可以在培养基中产生多于约５０００个拷贝的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：A翁，R伯恩，LM雷德，
申请(专利权)人：沃泰克斯药物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]