基于二泛素突变蛋白的Her2 结合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及基于二泛素突变蛋白的新型Her2结合分子。本发明专利技术进一步涉及可选地融合至或结合至调节药代动力学的部分或者融合至或结合至治疗或诊断活性组分的Her2结合蛋白。本发明专利技术还涉及这些Her2结合蛋白在医药中的用途，优选地用于诊断或治疗癌症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于二泛素突变蛋白的Her2结合蛋白
本专利技术涉及基于二泛素突变蛋白(di-ubiquitinmutein)的新Her2结合分子。本专利技术还涉及Her2结合蛋白，其可选地融合(fuse)至或结合(conjugate)至调节药代动力学的部分或者融合至或结合至治疗或诊断活性组分。本专利技术还涉及这些Her2结合蛋白在医药中的用途，优选用于诊断或治疗癌症。
技术介绍
膜结合受体酪氨酸激酶Her2的表达增加在许多乳腺癌的发展和进展中起重要作用，而且在卵巢癌、胃癌和子宫癌中尤其是侵袭性癌症中也起重要作用。针对恶性肿瘤(主要是上皮起源的恶性肿瘤)报道了这种致癌基因的过表达，并且与癌症复发和预后不良有关。三结构域蛋白(细胞外、跨膜、细胞内酪氨酸激酶结构域)介导细胞增殖和抑制细胞凋亡。当配体结合到Her2的细胞外结构域时，Her2与受体形成二聚体，从而Her2的细胞内结构域被激活，这介导细胞过程如增殖、分化、迁移或凋亡。因此，调节Her2的功能是癌症治疗发展的重要手段，特别是基于结合至Her2细胞外结构域的单克隆抗体的那些。治疗性抗Her2单克隆抗体如曲妥珠单抗(Trastuzumab)或帕妥珠单抗(Pertuzumab)可用于治疗癌症，特别是乳腺癌。本专利技术的技术问题然而，单克隆抗体具有诸如分子结构复杂、大尺寸和具挑战性的生产方法等主要缺点。另外，使用目前可用的Her2结合分子治疗疾病并非在所有患者中有效，并且可能具有严重的副作用。不用说，对于使用改进的新型药剂来有效治疗癌症，特别是有效的肿瘤靶向治疗和诊断存在强烈的医学需要。目前仍然需要寻找现有疗法和诊断的替代方法，即用较小和较不复杂的Her2特异性分子(例如基于非免疫球蛋白的Her2结合剂)代替Her2单克隆抗体。为了克服抗体的缺点，适用于诊断和治疗应用的新型Her2结合分子应包括诸如对Her2的亲和力、对Her2的特异性以及高稳定性等特性。因此，本专利技术的目的是提供新的Her2结合非免疫球蛋白分子，用于治疗和诊断具有Her2过表达的癌症的新的和改进的策略。特别地，目的是提供对Her2具有高亲和力和特异性的新型结合蛋白，其结合了较不复杂且更小的结构，例如用于实现简化的分子工程。本专利技术通过小Her2结合蛋白诸如基于非免疫球蛋白的结合剂，特别是基于泛素突变蛋白的Her2结合分子(也称为分子)，提供了一种解决方案。与抗体相比，本专利技术的Her2结合蛋白的显著优点是在(i)尺寸减小(例如最大152个氨基酸)、(ii)简单的分子结构(一条链相比于抗体的四条链)、和(iii)对全功能性可能的但不是必需的翻译后修饰方面降低了复杂性。本专利技术的结合蛋白提供的分子格式具有有利的物理化学性质(如稳定性和溶解性)、高水平表达并且允许容易的生产方法。本专利技术的Her2特异性Affilin分子的特征在于对Her2的高亲和力、对Her2的特异性以及高稳定性，并提供了新的治疗和诊断可能性。上述目标和优点是通过所附独立权利要求的主题来实现的。本专利技术通过提供基于二泛素突变蛋白的特异性Her2结合蛋白的实例来满足上述需要，在二泛素的至少12个氨基酸位置具有取代。在从属权利要求以及以下描述、实施例和附图中包括了本专利技术的优选实施方案。上述概述不一定描述本专利技术解决的所有问题。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术涉及Her2结合蛋白，其中所述Her2结合蛋白包含氨基酸序列，其中从二泛素(SEQIDNO:4)的位置R42、I44、H68、V70、R72、L73、R74、K82、L84、Q138、K139、E140、S141和T142中选择的至少12个氨基酸被取代，并且其中所述Her2结合蛋白与二泛素(SEQIDNO:4)具有至少85％的序列一致性，并且其中所述Her2结合蛋白对Her2具有低于700nM的结合亲和力(KD)，优选所述结合亲和力是通过ELISA或通过表面等离子体共振测定法来确定的。本专利技术的另一方面涉及Her2结合蛋白，其进一步包含至少一种附加分子，该附加分子优选地选自由以下各项组成的组(i)、(ii)和(iii)中的至少一个成员：(i)调节药代动力学行为的部分，选自例如聚乙二醇、人血清白蛋白(HSA)、人血清白蛋白结合蛋白、白蛋白结合肽、或免疫球蛋白或免疫球蛋白片段、多糖；和(ii)治疗性活性组分，可选地选自例如单克隆抗体或其片段、细胞因子、趋化因子、细胞毒性化合物、酶、或它们的衍生物、或放射性核素；和(iii)诊断组分，可选地选自例如荧光化合物、光敏剂、标签、酶或放射性核素。在进一步方面，本专利技术还提供了编码包含本专利技术的结合蛋白或由本专利技术的结合蛋白组成的Her2结合蛋白的核酸或多个核酸，以及包含所述核酸或多个核酸的载体或多个载体，和包含所述载体或多个载体的宿主细胞或多个宿主细胞。另一方面涉及用于在诊断或药物中使用(优选用于诊断或治疗癌症)的所述Her2结合蛋白，或编码所述Her2结合蛋白的核酸分子，或包含所述Her2结合蛋白的载体，或包含所述Her2结合蛋白的宿主细胞，或包含所述Her2结合蛋白的非人类宿主。另一方面涉及一种组合物，其包含本专利技术的Her2结合蛋白、本专利技术的核酸分子、本专利技术的载体、或本专利技术的宿主细胞，优选用于诊断或治疗癌症。本专利技术的另一方面涉及一种用于生产本专利技术前述方面中任一项所述的Her2结合蛋白的方法，包含在适合的条件下培养宿主细胞和可选地分离所产生的Her2结合蛋白。本
技术实现思路
部分不一定描述了本专利技术的全部特征。通过审阅随后的详细描述，其它实施方案将变得显而易见。附图说明附图显示：图1示出了Her2结合Affilin分子。图1A列出了为产生Her2结合蛋白而被取代的二泛素(SEQIDNO:4)的位置。在第一行中列出相应的氨基酸位置。所有Her2结合蛋白(例如SEQIDNO:5-38)在从SEQIDNO:4的位置R42、I44、H68、V70、R72、L73、R74、K82、L84、Q138、K139、E140、S141和T142中选择的至少12个位置被取代。表中的“.”是指野生型位置(未改变的)；例如，如SEQIDNo:6、31、33、34、35、36和37中所例示的。图1B示出了与图1A的相同氨基酸交换，然而，交换根据以下代码进行翻译，其将具有相似生物物理性质的氨基酸进行分组(group)。波浪线“”是极性氨基酸(T、S、N或Q)的符号，“H”是疏水性氨基酸(例如A、M、L、V、I)的符号，“o”是芳香族氨基酸(例如F、W、Y)的符号，“+”是碱性氨基酸(例如K、R、H)的符号，“-”是酸性氨基酸(例如D、E)的符号，且“G”对应于甘氨酸。图1C列出了进一步的取代；除了从SEQIDNO:4的氨基酸位置R42、I44、H68、V70、R72、L73、R74、K82、L84、Q138、K139、E140、S141和T142中选择的至少12个取代之外，所有的Her2结合蛋白具有0、1、2、3、4、5或6个其它修饰。图1D示出了与图1C的相同氨基酸交换，但是根据代码进行翻译，所述代码将具有类似生物物理性质的氨基酸进行分组(group)(如图1B所述)。图2.Her2结合Affilin分子(例如SEQIDNO:5-38)的生化表征。示出的是由SPR检测法(Biacore；表的第三列)获得的结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含氨基酸序列的Her2结合蛋白，其中选自二泛素(SEQ ID NO:4)的位置R42、I44、H68、V70、R72、L73、R74、K82、L84、Q138、K139、E140、S141和T142中的12、13或14个氨基酸被取代并且其中所述Her2结合蛋白与二泛素(SEQ ID NO:4)具有至少85％的序列一致性并且其中所述Her2结合蛋白对Her2的结合亲和力(KD)小于700nM。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.20 EP EP15177548.31.一种包含氨基酸序列的Her2结合蛋白，其中选自二泛素(SEQIDNO:4)的位置R42、I44、H68、V70、R72、L73、R74、K82、L84、Q138、K139、E140、S141和T142中的12、13或14个氨基酸被取代并且其中所述Her2结合蛋白与二泛素(SEQIDNO:4)具有至少85％的序列一致性并且其中所述Her2结合蛋白对Her2的结合亲和力(KD)小于700nM。2.根据权利要求1所述的Her2结合蛋白，包含二泛素(SEQIDNO:4)的1、2、3、4、5或6个其它取代。3.根据权利要求1或2所述的Her2结合蛋白，其中所述氨基酸选自：位置42被极性氨基酸取代，位置44被疏水性氨基酸或极性氨基酸取代，位置68被芳族氨基酸取代，位置70被芳族氨基酸取代，位置72被极性氨基酸或芳族氨基酸取代，位置73被除了碱性氨基酸或酸性氨基酸之外的任何氨基酸取代，位置74被芳族氨基酸、碱性氨基酸或极性氨基酸取代，位置82被除了碱性氨基酸或酸性氨基酸之外的任何氨基酸取代，位置84被碱性氨基酸或酸性氨基酸取代，位置138被碱性氨基酸或酸性氨基酸或极性氨基酸取代，位置139被酸性氨基酸或疏水性氨基酸或甘氨酸取代，位置140被芳族氨基酸取代，位置141被疏水性氨基酸或极性氨基酸或碱性氨基酸取代，和/或位置142被疏水性氨基酸或极性氨基酸取代。4.根据权利要求3所述的Her2结合蛋白，其中所述氨基酸选自R42T、R42S、R42L、I44A、I44V、I44S、I44T、H68W、H68Y、H68F、V70Y、V70W、R72T、R72F、R72G、R72Y、L73W、L73S、L73V、L73I、R74Y、R74S、R74N、R74K、K82T、K82L、K82N、K82I、K82Y、L84H、L84D、L84E、L84S、Q138S、Q138R、Q138E、K139E、K139G、K139L、E140W、S141A、S141R、T142I、T142L和/或T142N。5.根据权利要求4所述的Her2结合蛋白，其中所述氨基酸选自Q138S、K139E、E140W、S141A和T142I；...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗洛里安·塞泰莱，玛德勒恩·茨瓦格，玛加·格洛泽，伊瓦·博塞德内克，埃里克·菲德勒，乌尔里希·豪普茨，
申请(专利权)人：纳维格蛋白质有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE