用于亲和纯化的免疫球蛋白结合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及免疫球蛋白(Ig)结合蛋白，其包含具有带有支链侧链的高度疏水性氨基酸(Iso、Leu、Val)或者芳香族氨基酸(Tyr、Phe或Trp)的一个或多个结构域，这些氨基酸对应于SEQ ID NO：1的Ig结合蛋白或功能类似蛋白的位置4或6或8。该新型蛋白对于抗体(免疫球蛋白)的高效纯化方法具有优良性质，例如，该蛋白具有高结合量和高化学稳定性。本发明专利技术还涉及包含本发明专利技术的Ig结合蛋白的亲和基质。本发明专利技术还涉及这些Ig结合蛋白或亲和基质用于亲和纯化免疫球蛋白的用途，并且涉及使用本发明专利技术的Ig结合蛋白的亲和纯化方法。和纯化方法。和纯化方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于亲和纯化的免疫球蛋白结合蛋白


[0001]本专利技术涉及免疫球蛋白(Ig)结合蛋白，其包含具有带有支链侧链的高度疏水性氨基酸(Iso、Leu、Val)或者芳香族氨基酸(Tyr、Phe或Trp)的一个或多个结构域，这些氨基酸对应于SEQ ID NO：1的Ig结合蛋白或功能类似蛋白的位置4或6或8。该新型蛋白对于抗体(免疫球蛋白)的高效纯化方法具有优良性质，例如，该蛋白具有高结合量和高化学稳定性。本专利技术还涉及包含本专利技术的Ig结合蛋白的亲和基质。本专利技术还涉及这些Ig结合蛋白或亲和基质用于亲和纯化免疫球蛋白的用途，并且涉及使用本专利技术的Ig结合蛋白的亲和纯化方法。

技术介绍

[0002]多种生物技术和药物应用需要从含有抗体的样品中去除污染物。捕获和纯化抗体的既定程序是亲和色谱，其使用来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细菌细胞表面蛋白A作为免疫球蛋白的选择性配体(参见，例如，Huse et al.,J.Biochem.Biophys.Methods 51,2002:217
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231的综述)。野生型蛋白A以高亲和力和选择性结合IgG分子的Fc区。具有改善的性质，如碱性稳定性的蛋白A的变体对于纯化抗体可用，并且包含蛋白A配体的多种色谱基质是可商购的。然而，目前可用的基于蛋白A的色谱基质在暴露于碱性条件后显示失去对免疫球蛋白的结合能力并且需要在低于4的pH下的洗脱条件。
[0003]本专利技术的技术问题
[0004]大多数抗体或含Fc的融合蛋白的大规模生产过程使用蛋白A进行亲和纯化。然而，由于蛋白A在亲和色谱中的应用的限制，本领域需要提供具有改善性质的新型Ig结合蛋白，其特异性结合免疫球蛋白以有助于免疫球蛋白的亲和纯化。为了最大限度地利用包含Ig结合蛋白的色谱基质的价值，期望多次使用亲和配体基质。在色谱循环之间，需要进行彻底的清洗程序以消毒和去除基质上残留的污染物。在该程序中，一般的做法是将含有高浓度的NaOH的碱性溶液应用于亲和配体基质。野生型蛋白A结构域不能长时间承受这种苛刻的碱性条件，并且快速失去对免疫球蛋白的结合能力。此外，对于亲和配体基质的重复使用，需要在苛刻的酸性条件下进行清洗步骤。
[0005]因此，本领域持续需要获得能够结合包含Ig序列的蛋白质(例如，抗体)并耐受免疫球蛋白亲和纯化中应用的苛刻清洗条件的新型蛋白质。
[0006]本专利技术提供了特别适用于免疫球蛋白的亲和纯化的Ig结合蛋白。具体地，本专利技术的Ig结合蛋白具有几个优势。本专利技术的Ig结合蛋白的一个显著优势是它们在高pH值下对于延长的一段时间(如大于2天)的改善的稳定性，同时不会降低Ig结合能力以及高动态结合能力。此外，本专利技术的新型蛋白对于其中需要弱酸洗脱条件的抗体的亲和纯化特别有用。
[0007]以上概述不必然描述通过本专利技术所解决的所有问题。

技术实现思路

[0008]本专利技术的一个方面是提供适用于亲和纯化的Ig结合蛋白。
[0009][1]这通过包含一个或多个Ig结合结构域的免疫球蛋白(Ig)结合蛋白实现，其中至少一种Ig结合结构域对应于与SEQ ID NO：1(cs26)具有至少80％的氨基酸同一性的Ig结合蛋白，其中对应于SEQ ID NO：1的位置4、6或8的氨基酸为异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)或者芳香族氨基酸。该Ig结合蛋白是碱性稳定的(在0.5M NaOH下至少20h)。在各个实施方式中，Ig结合蛋白包含一个或多个Ig结合结构域，其中至少一种Ig结合结构域对应于与SEQ ID NO：1具有至少80％的氨基酸同一性的Ig结合蛋白，其中对应于SEQ ID NO：1的位置8的氨基酸为异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)或芳香族氨基酸，并且其中Ig结合蛋白在0.5M NaOH的碱性条件下稳定至少20h。
[0010][2]根据项目[1]的Ig结合蛋白，其中
[0011](a)对应于SEQ ID NO：1的位置8的氨基酸为异亮氨酸(I)或酪氨酸(Y)，优选地其中对应于SEQ ID NO：1的位置8的氨基酸为异亮氨酸(I)，或者
[0012](b)其中对应于SEQ ID NO：1的位置4的氨基酸为色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)，或者
[0013](c)其中对应于SEQ ID NO：1的位置6的氨基酸为异亮氨酸(I)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)或亮氨酸(L)。
[0014][3]根据项目[1]或[2]的Ig结合蛋白，其中对应于SEQ ID NO：1的位置10、14、16、17、18或28的一个或多个氨基酸选自组氨酸(H)，或者选自天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)的酸性氨基酸的组，优选地在位置14或28处。在各个实施方式中，Ig结合蛋白与SEQ ID NO：1(cs26)具有至少80％的氨基酸同一性，其中对应于SEQ ID NO：1的位置8的氨基酸为异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)或缬氨酸(V)或芳香族氨基酸，并且对应于SEQ ID NO：1的位置14的氨基酸为组氨酸。在各个实施方式中，Ig结合蛋白与SEQ ID NO：1(cs26)具有至少80％的氨基酸同一性，其中对应于SEQ ID NO：1的位置8的氨基酸为异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)或缬氨酸(V)或芳香族氨基酸，对应于SEQ ID NO：1的位置14的氨基酸为组氨酸(H)，并且对应于SEQ ID NO：1的位置29的氨基酸为赖氨酸(K)。优选地，对应于SEQ ID NO：1的位置8的氨基酸为异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)或芳香族氨基酸，其可以是色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)中的任一种。更优选地，对应于SEQ ID NO：1的位置8的氨基酸为异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)，更优选地对应于SEQ ID NO：1的位置8的氨基酸为异亮氨酸(I)。在各个实施方式中，Ig结合蛋白可以在对应于SEQ ID NO：1的位置43或46的位置处具有半胱氨酸(C)残基。
[0015][4]根据项目[1]‑
[3]中任一项的Ig结合蛋白，其中对应于SEQ ID NO：1的位置29的氨基酸为赖氨酸(K)。
[0016][5]根据项目[1]‑
[4]中任一项的Ig结合蛋白，其中至少一种结构域包含SEQ ID NO：4
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36和40
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49中任一项所示的氨基酸序列或由其组成。在各个实施方式中，Ig结合蛋白包含SEQ ID NO：4
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9、20
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36和40
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49中任一项所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：4
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36、40
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49中任一项具有至少89.5％的同一性的氨基酸序列。
[0017][6]根据项目[1]‑
[5]中任一项的Ig结合蛋白，其中蛋白结合至IgG1、IgG2、IgG4、IgM、IgA、Ig片段、Fc片段、Fab片段、包含Ig区的融合蛋白和包含Ig区的缀合物中的一种或多种。在各个实施方式中，Ig结合蛋白结合至包含Fc区的蛋白或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种免疫球蛋白(Ig)结合蛋白，包含一个或多个Ig结合结构域，其中至少一个Ig结合结构域对应于与SEQ ID NO：1具有至少80％的氨基酸同一性的Ig结合蛋白，其中对应于SEQ ID NO：1的位置8的氨基酸为异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)或芳香族氨基酸，并且其中Ig结合蛋白在0.5M NaOH的碱性条件下稳定至少20h。2.根据权利要求1所述的Ig结合蛋白，其中，对应于SEQ ID NO：1的位置8的氨基酸为异亮氨酸(I)或酪氨酸(Y)。3.根据权利要求1
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2所述的Ig结合蛋白，其中，对应于SEQ ID NO：1的位置10、14、16、17、18或28的一个或多个氨基酸选自组氨酸(H)或天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)的组。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的Ig结合蛋白，其中，至少一个结构域包含SEQ ID NO：4
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9、20
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26和40
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49中任一项的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：4
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9、20
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26和40
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49中任一项具有至少89.5％的同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的Ig结合蛋白，其中，所述蛋白结合至IgG1、IgG2、IgG4、IgM、IgA、Ig片段、Fc片段、Fab片段、包含Ig区的融合蛋白和包含Ig区的缀合物。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的Ig结合蛋白，其中，所述蛋白包含2、3、4、5或6个彼此连接的结构域。7.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：保罗，
申请(专利权)人：纳维格蛋白质有限公司，
类型：发明
国别省市：