本发明专利技术提供了干扰肌肉特异Ｅ３泛素蛋白连接酶基因表达的方法，具体地Ａｔｒｏｇｉｎ－１基因和ＭｕＲＦ１基因的干扰ＲＮＡ及其ＤＮＡ序列，包含其的载体和由所述载体转录的干扰ＲＮＡ，以及将所述干扰ＲＮＡ序列，包含其的载体和由所述载体转录的干扰ＲＮＡ用于制备预防和治疗肌肉萎缩疾病的药物中的应用。在细胞水平和实验动物上，本发明专利技术的干扰ＲＮＡ序列将Ａｔｒｏｇｉｎ－１基因和ＭｕＲＦ１基因的表达分别比对照降低６０％和３０％左右，肌肉细胞分化水平分别比对照升高７０％和３０％左右。在实验动物上表现出明显的肌肉萎缩治疗效果，有效提高疾病发生时的肌肉质量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地涉及针对肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因，具 体地Atrogin-l和MuRF 1的干扰RNA，包含所述干扰RNA的载体，由所述载体转录的干扰 RNA及其在制备用于预防或治疗肌肉萎縮的药物中的应用。
技术介绍
肌肉萎縮系指骨骼肌肉体积縮小，肌纤维减少或变细甚至消失。多种因素均可 导致肌肉萎縮的发生，严重的疾病如乙肝、糖尿病、艾滋病、肾衰竭等。肌肉萎縮的主要表现 之一是骨骼肌蛋白分解丢失，其降解通过3类蛋白酶途径溶酶体蛋白酶、钙依赖蛋白酶和 泛素-蛋白酶，后者最为重要。Atrogin-l和MuRF 1都属于肌肉特异性E3泛素连接蛋白 酶，发生肌肉萎縮时Atrogin-l和MuRF 1的表达都升高(Claved et al. 2006) 。 Atrogin — 1基因含有一个F-box功能结构域，此酶在骨骼肌中特异性地高表达。多种疾病导致的营 养不良和骨骼肌萎縮都伴有Atrogin-l基因表达上调(Gomes et al. ，2005)。最新的研究 显示Atrogin-l的表达量在肌肉萎縮临床症状出现以前就有所提高，说明导致肌肉萎縮， 首先产生Atrogin-l基因表达量升高，并使肌肉细胞中蛋白质非正常降解(Glass, 2005)。 Atrogin-l蛋白降解途径可以与细胞自噬途径协同作用，导致更多蛋白的降解。 为了探讨小RNA在肌肉萎縮中应用的途径，刘长梅等研究了用化学合成的针对 Foxo-l基因的干扰RNA经进一步研究有抑制鼠肌肉萎縮的作用(Liu et al. ，2007)。刘 长梅等还研究了化学合成的针对Myostatin反义RNA对小鼠肌肉萎縮有抑制作用(Liu et al. 2008)。通过大剂量的直接注射经过修饰的耙向GDF-8、F0X0-1基因的有效干扰片段，可 以明显的观察到小鼠的肌肉质量的改善。由于化学合成的干扰RNA除价格昂贵外，其靶向 性差，特异性较低以及作用持续时间短等因素，导致干扰效果欠佳。为了探索应用性更佳的 药物施入方式，刘长梅等应用逆转录病毒系统转录的干扰RNA使GDF-8基因沉默，其治疗肌 肉萎縮病的效果更好(Yang etal.2008)。 本专利技术的申请人针对上述问题，设计了针对肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因，具 体地Atrogin-l基因和MuRF 1基因的干扰RNA序列，并将其编码DNA序列构建到腺病毒载 体或小环DNA载体中，申请人的实验结果证明，本专利技术设计的干扰RNA序列以及包含其的 载体可以有效地抑制肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因Atrogin-l基因和MuRF 1基因的 表达，提高疾病发生时的肌肉质量，同时所构建的腺病毒载体转录的干扰RNA相比于化学 合成的干扰RNA靶向性更好，特异性更强，具有更好的稳定性，能够克服化学合成干扰RNA 的不稳定，药物作用持续时间短，吸收量少的特点，相比于逆转录病毒载体具有更好的安全 性，作用效果稳定，而小环DNA系统在此基础上相比于传统的腺病毒载体和逆转录病毒载 体还具有更好的安全性，药物作用持续时间长，可以多次免疫的优点。 参考文献 [l]Clavel S， Coldefy AS， Kurkdjian E， et al. Atrophy—related ubiquitinligases， atrogin_land MuRF lare up_regulated in aged rat Tibialis Anterior muscle. Mech Ageing Dev ;127(10) :794-801,2006. [2]Marcelo D. Gomes， Stewart H丄ecker， R. Thomas Jagoe，Ami Navon， andAlfred L Goldberg. Atrogin—l, a muscle—specific F_box protein highlyexpressed during muscle atrophy. PNAS，98(25) : 14440-14445，2001. [3]David J. Glass. Ske 1 eta 1 muscle hypertrophy and atrophy signalingpathways. The International Journal of Biochemistry&Cell Biology,37: 1974-1984,2005. [4]Chang_Mei Liu，Zhuo Yang，Chao-Wu Liu，Rong Wang，Po Tien，RoderickDale and Um_Quan Sim. Effect of RNA oligonucleotide targeting Foxo_lon muscle growth in normal and cancer cachexia mice. Cancer GeneTher即y. 14 (12) :945-52,2007. [5]Chang_Mei Liu，Zhuo Yang，Chao-Wu Liu，Rong Wang，Po Tien，RoderickDale and Um_Quan Sim. Myostatin antisense RNA_mediated musclegrowth in normal and cancer cachexia mice. Gene Therapy. 15(3) :155-60,2008. [6]Zhuo Yang， Jing-Wu Zhang， Hao-Long Cong， Zeng-Hong Huang， Um_Quan S皿，Chang_Mei Liu and Po Tien. A retrovirus—based system tostably silence G DF_8expression and enhance differentiation in h咖anrhabdomyosarcoma cell. Jo皿al of Gene Medicine, 10 :825-833， 2008. [7]Baer M， Nilsen T W， Costigan C， Altman S. Structure and transcription ofa human gene for H IRNA， the RNA component of human Rnase P. Nucleic Acids Res. 1990Jan 11 ;18(1) :97-103.
技术实现思路
本专利技术提供下列 第一方面，提供一种用于预防和治疗肌肉萎縮的载体转录的干扰RNA。在一个实施 方案中，所述干扰RNA，其靶向肌特异E3泛素蛋白连接酶基因。在一个实施方案中，所述肌 肉特异E3泛素蛋白连接酶基因为Atrogin-l基因(SEQ ID NO :7)或MuRF 1 (SEQ ID NO: 8)基因。在一个实施方案中，所述干扰RNA耙向所述Atrogin-l的3'端、5'端或中间区域 序列和/或所述MuRF l基因的3'端、5'端或中间区域序列。在一个实施方案中，所述干 扰RNA的DNA编码序列是SEQ ID NO :1，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于预防和治疗肌肉萎缩的载体转录的干扰ＲＮＡ。
【技术特征摘要】
一种用于预防和治疗肌肉萎缩的载体转录的干扰RNA。2. 权利要求l的干扰RNA，其靶向肌特异E3泛素蛋白连接酶基因。3. 权利要求1的干扰RNA，所述肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因为Atrogin-l基因 (SEQ ID NO :7)或MuRF 1 (SEQ ID NO :8)基因。4. 权利要求1的干扰RNA，其靶向所述Atrogin-l的3'端、5'端或中间区域序列和/ 或所述MuRF 1基因的3'端、5'端或中间区域序列。5. 权利要求l的干扰RNA，其中所述载体是病毒载体或质粒载体。6. —种干扰RNA，其编码DNA序列与权利要求1_5任一项的干扰RNA的编码DNA序列 相同。7. —种载体，其包含编码权利要求1-6任一项的干扰RNA...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘长梅，田波，丛浩龙，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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