抗EGFR突变体III单克隆抗体、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种抗EGFR突变体III单克隆抗体，该抗EGFR突变体III单克隆抗体的VH链的互补区CDR具有选自下组的CDR氨基酸序列：SEQ ID NO 1所示的CDR1，SEQ ID NO 2所示的CDR2，SEQ ID NO 3所示的CDR3。本发明专利技术的抗EGFR突变体III单克隆抗体，通过实验验证其与野生型EGFR无交叉反应，免疫印迹和免疫荧光实验表明该抗EGFR突变体III单克隆抗体具有很高的特异性和很高敏感性，可以准确检测肿瘤细胞系以及肿瘤组织中EGFR突变体III的表达情况，可很好的用于肿瘤组织(细胞)EGFRvIII的检测，可广泛应用于肿瘤细胞的检测和治疗领域。

Anti EGFR mutant III monoclonal antibody, preparation method and its application

The invention discloses an anti III monoclonal antibody EGFR mutant, the EGFR mutant anti III monoclonal antibody VH chain complementary region CDR is selected from the group consisting of CDR amino acid sequence: SEQ ID NO 1 shown in CDR1, SEQ ID NO 2 shown in CDR2, SEQ ID NO 3 shown in CDR3. EGFR resistant mutant III monoclonal antibody of the invention, through the experiment and the wild type EGFR without cross reaction, Western blot and immunofluorescence experiment showed that the anti EGFR mutant III monoclonal antibody with high specificity and high sensitivity, can accurately detect the expression of tumor cell lines and tumor tissues of EGFR mutant III. Can be very good for the tumor tissue (EGFRvIII cells) detection, detection and treatment can be widely used in the field of tumor cells.

【技术实现步骤摘要】
抗EGFR突变体III单克隆抗体、制备方法及其应用
本专利技术涉及抗体领域，特别是涉及抗EGFR突变体III(EGFRvIII)的单克隆抗体、制备方法及其应用。
技术介绍
表皮生长因子受体(EGFR)是一个由原癌基因c-(erbB)-1编码的相对分子质量为170000的跨膜糖蛋白。它是erbB受体酪氨酸激酶家族成员之一，具有受体酪氨酸激酶的活性。该家族包括：EGFR或人类EGF相关受体(HER)-1(erbB-1)、HER2(neu或erbB2)、HER3(erbB3)和HER4(erbB-4)，均定位于细胞膜上。人EGFR基因位于第7号染色体p13～q22区，全长200kb，由28个外显子组成，编码1186个氨基酸。EGFRvIII则是由EGFR基因内5’端外显子2～7发生缺失型变异而产生。EGFRvIII缺失801个碱基对，对应于EGFR胞外段6～273位氨基酸，并在断端融合处产生了一个甘氨酸。EGFR包括胞外段、跨膜区和胞内段。胞外段由I、II、III、IV四个区组成。EGFRvIII缺失了胞外I区和II区的大部分，丧失了与配体的结合位点，因而不具备与配体结合的能力。到目前为止，EGFRvIII在27％～50％的乳腺癌、将近6l％的恶性胶质瘤、39％的肺癌以及73％的卵巢癌中均被检测到，而在多种正常组织中未检测到，如乳腺、小肠、肾、睾丸、肺、脑、肝、皮肤、末梢神经、淋巴结、卵巢、骨髓、脾、子宫内膜和胎盘。在如此多的肿瘤中检测到EGFRvIII的高表达，表明EGFRvIII在致瘤过程中起重要作用，其表达与肿瘤细胞致瘤性的提高有着密切的关系。目前，市场上尚无商品化的靶向EGFRvIII的小鼠单克隆抗体出售，兔多克隆抗体的特异性比较差，且由于多克隆抗体和单克隆抗体的制备方法以及免疫抗原的设计等因素，文献报道的和市场上已有的商品化的抗EGFRvIII的抗体均不同程度上与野生的EGFR存在交叉反应，抗EGFRvIII的抗体的特异性差，测得结果的准确性差。亟待进一步开发新的与野生的EGFR不存在交叉反应的抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗EGFR突变体III单克隆抗体，该单克隆抗体的应用以及该单克隆抗体的方法，该单克隆抗体的特异性好，与野生型EGFR无交叉反应。为解决上述技术问题，本专利技术一种抗EGFR突变体III单克隆抗体，该抗EGFR突变体III单克隆抗体的VH链的互补区CDR具有选自下组的CDR氨基酸序列：SEQIDNO1所示的CDR1，SEQIDNO2所示的CDR2，SEQIDNO3所示的CDR3；该抗EGFR突变体III单克隆抗体的VL链的氨基酸序列为SEQIDNO4所示。所述抗EGFR突变体III单克隆抗体蛋白的分子量为150KD。所述抗EGFR突变体III单克隆抗体为IgG2a亚型。所述抗EGFR突变体III单克隆抗体与野生型EGFR无交叉反应。所述抗EGFR突变体III单克隆抗体的免疫抗原为氨基酸多肽序列为SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7与蛋白KLH偶联得到的；所述氨基酸多肽的纯度大于90％。本专利技术提供一种具有上述所述的抗EGFR突变体III单克隆抗体的VH链的互补区CDR和VL链氨基酸序列的衍生物。本专利技术还提供抗EGFR突变体III单克隆抗体在制备治疗乳腺癌、恶性胶质瘤、肺癌、卵巢癌的药物中的应用。所述的抗EGFR突变体III单克隆抗体在制备检测恶性肿瘤的免疫检测试剂盒中的应用。本专利技术提供一种分泌所述的抗EGFR突变体III单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本专利技术提供一种制备所述的杂交瘤细胞系的方法，其包括以下步骤：步骤A：构建免疫抗原，将序列分别为SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7的氨基酸多肽与载体蛋白KLH偶联，获得免疫抗原；步骤B:将所述免疫抗原与福氏完全佐剂混合，分点皮下注射三只Balb/c小鼠，每只Balb/c小鼠每次注射量为80-120μg；步骤C：将所述免疫抗原与福氏不完全佐剂的乳化液，在进行细胞融合前3天，经腹腔注射三只Balb/c小鼠含100-200ug抗原的生理盐水溶液；步骤D：取免疫小鼠的尾血进行间接ELISA法检测，确定其中一只Balb/c脾细胞为备选的杂交瘤细胞制备；步骤E：将所述脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000进行融合，用HAT培养液选择培养、筛选杂交瘤细胞株；步骤F：重复所述步骤E，筛选得到稳定分泌所述抗EGFR突变体III的四株单克隆抗体杂交瘤细胞系；步骤G：对所述四株杂交瘤细胞系所得的单克隆抗体进行效价检测，选取信号最强的杂交瘤细胞系；步骤H：将所述步骤G中得到的杂交瘤细胞系传代培养，得到可以持续稳定分泌抗EGFRvIII的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本专利技术的抗EGFR突变体III单克隆抗体，通过实验验证其与野生型EGFR无交叉反应，免疫印迹和免疫荧光实验表明该抗EGFR突变体III单克隆抗体具有很高的特异性和很高敏感性，可以准确检测肿瘤细胞系以及肿瘤组织中EGFR突变体III(EGFRvIII)的表达情况，可很好的用于肿瘤组织(细胞)EGFRvIII的检测，可广泛应用于肿瘤细胞的检测和治疗领域。下面通过附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。附图说明上述仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术，以下结合附图与具体实施方式对本专利技术作进一步的详细说明。下面结合附图和具体实施方式对本专利技术做进一步详细说明。图1为本专利技术的抗EGFRvIII单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图；图2为本专利技术的抗EGFRvIII单克隆抗体的免疫球蛋白亚类鉴定图；图3为本专利技术的抗EGFRvIII单克隆抗体的western-blot图；图4为现有的靶向EGFRvIII的兔源多克隆抗体的免疫荧光实验结果图；图5为本专利技术的本专利技术的抗EGFRvIII的单克隆抗体的免疫荧光实验结果图；图6为本专利技术的人星形胶质细胞瘤II期抗EGFRvIII的单克隆抗体免疫组织化学染色结果图；图7为本专利技术的人肝细胞肝癌III期抗EGFRvIII的单克隆抗体免疫组织化学染色结果图；图8为本专利技术的人浆液性乳头状卵巢癌IIc期抗EGFRvIII的单克隆抗体免疫组织化学染色结果图；图9为本专利技术的人低分化胃腺癌IIIa期抗EGFRvIII的单克隆抗体免疫组织化学染色结果图；图10为本专利技术的人乳腺浸润性导管癌IIIb期抗EGFRvIII的单克隆抗体免疫组织化学染色结果图；图11为本专利技术的人结肠黏液癌IIIc期抗EGFRvIII的单克隆抗体免疫组织化学染色结果图；图12为本专利技术的人低分化肺腺癌Ib期抗EGFRvIII的单克隆抗体免疫组织化学染色结果图。具体实施方式本专利技术的抗EGFR突变体III单克隆抗体，EGFR突变体III即EGFRvIII表皮生长因子受体III型突变体，该抗EGFR突变体III单克隆抗体的VH链的互补区CDR具有选自下组的CDR氨基酸序列：SEQIDNO1所示的CDR1，SEQIDNO2所示的CDR2，SEQIDNO3所示的CDR3。该抗EGFR突变体III单克隆抗体的VL链的氨基酸序列如SEQIDNO4所示，SEQIDNO4：PKFLLVSPGDRVTITCKASQSVSNDVDWYQQKPGQSPKLLIY本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗EGFR突变体III单克隆抗体，其特征在于，该抗EGFR突变体III单克隆抗体的VH链的互补区CDR具有选自下组的CDR氨基酸序列：SEQ ID NO 1所示的CDR1，SEQ ID NO 2所示的CDR2，SEQ ID NO3所示的CDR3；该抗EGFR突变体III单克隆抗体的VL链的氨基酸序列为SEQ ID NO 4所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗EGFR突变体III单克隆抗体，其特征在于，该抗EGFR突变体III单克隆抗体的VH链的互补区CDR具有选自下组的CDR氨基酸序列：SEQIDNO1所示的CDR1，SEQIDNO2所示的CDR2，SEQIDNO3所示的CDR3；该抗EGFR突变体III单克隆抗体的VL链的氨基酸序列为SEQIDNO4所示。2.根据权利要求1所述的抗EGFR突变体III单克隆抗体，其特征在于，所述抗EGFR突变体III单克隆抗体蛋白的分子量为150KD。3.根据权利要求1所述的抗EGFR突变体III单克隆抗体，其特征在于，所述抗EGFR突变体III单克隆抗体为IgG2a亚型。4.根据权利要求1所述的抗EGFR突变体III单克隆抗体，其特征在于，所述抗EGFR突变体III单克隆抗体与野生型EGFR无交叉反应。5.根据权利要求1所述的抗EGFR突变体III单克隆抗体，其特征在于，所述抗EGFR突变体III单克隆抗体的免疫抗原为氨基酸多肽序列为SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7与蛋白KLH偶联得到的；所述氨基酸多肽的纯度大于90％。6.一种具有权利要求1所述的抗EGFR突变体III单克隆抗体的VH链的互补区CDR和VL链氨基酸序列的衍生物。7.权利要求1至权利要求6中任一项所述的抗EGFR突变体III单克隆抗体在制备治疗乳腺癌、恶性胶质瘤、肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌的药物中的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈丽，刘旭杰，王凡，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11