用不含探针的荧光PCR方法检测病毒毒力技术

本发明专利技术属于生物与医学领域，可以用于动植物检疫等方面。本发明专利技术利用不含探针的荧光ＰＣＲ方法检测病毒毒力；本发明专利技术在利用不含探针的荧光ＰＣＲ方法检测病毒毒力时，采用通过比较两套或两套以上引物的扩增效率的方法来区分强毒毒株和弱毒毒株；本发明专利技术在利用不含探针的荧光ＰＣＲ方法检测病毒毒力时，采用Ｔｍ值大于或等于６３℃的引物；本发明专利技术利用不含探针的荧光ＰＣＲ检测新城疫病毒的毒力；本发明专利技术在利用不含探针的荧光ＰＣＲ检测新城疫病毒的毒力时，设计了三条新的引物；本发明专利技术在利用不含探针的荧光ＰＣＲ检测新城疫病毒的毒力时，按照不完全配对的方式设计了针对新城疫弱毒核酸序列特征的引物。

【技术实现步骤摘要】
1.
本技术属于生物与医学领域。本技术用来检测某些动物病毒和植物病毒的毒力强弱，可以用于动植物检疫等方面。2.
技术介绍
病毒是动物和植物重要的传染病的病原。属于同一种病毒的不同的毒株毒力强弱可以不一样，即对动物或植物致病能力可以不一样。检测病毒毒力的强弱对于动植物检疫等领域具有重要的意义。例如，新城疫病毒是鸡的重要病原之一，在鸡或鸡产品(如鸡肉)中检测到新城疫病毒后，如果病毒被进一步鉴定为强毒，则需要按照国家有关规定禁止鸡或鸡产品进出口，并对有关鸡场采取扑杀和消毒等措施；如果病毒被进一步鉴定为弱毒，则鸡或鸡产品仍然能够进出口，并无需对有关鸡场采取扑杀和消毒等措施。常规的检测病毒毒力的方法是将病毒接种易感动物或植物，通过计算易感动物或植物发病数和死亡数等指标得出病毒毒力的大小。这种方法缺点至少有两个1)用费多；2)耗时长。有些病毒的毒力决定于病毒基因组中某一段序列。如新城疫病毒的毒力决定于新城疫病毒基因组中F基因编码区第330位到第360位之间的一段核酸序列，强毒毒株的序列和弱毒毒株的在这段核酸序列上有明显的不同特征。因此，根据这些不同的特征可以区分这些病毒毒力大小。检测核酸序列特征的方法有核酸探针和聚合酶链式反应(英文简写为PCR)两种方法。其中核酸探针灵敏度低，因此很少应用在实际工作当中。普通PCR虽然灵敏度高，但是需要在PCR之后用核酸电泳的方法来判断PCR的结果，而核酸电泳会带来难以避免的核酸污染和化学毒品污染等严重问题。荧光PCR是近十年来逐步发展成熟的一项PCR新技术。荧光PCR是通过检测荧光信号来判断PCR结果的一种方法。相对于普通PCR而言，荧光PCR具有许多优点1)不需要进行核酸电泳；2)避免了核酸电泳所带来的核酸污染和化学毒品污染等严重问题；3)能够实时和定量检测。荧光PCR有几种模式，但大致可以分为含有探针的荧光PCR和不含探针的荧光PCR。不含探针的荧光PCR的反应体系中没有探针，荧光物质要么直接加到反应体系中，要么标记引物上。引物是指引导脱氧核糖核酸合成反应的一段单链脱氧核糖核酸。含有探针的荧光PCR的反应体系中含有探针，探针是在普通PCR体系中添加了一条或几条探针。探针是指能够特异性结合被检测基因，但是不引导脱氧核糖核酸合成的一段单链脱氧核糖核酸。在含有探针的荧光PCR的反应体系中，荧光物质是标记在探针上面。标记荧光物质的探针价格非常昂贵。不含探针的荧光PCR和含有探针的荧光PCR相比，各有长短。不含探针的荧光PCR具有成本小、适合高度变异的基因检测，但是特异性略差一些。不含探针的荧光PCR往往可以测定Tm值，通过Tm的测定可以大大提高不含探针的荧光PCR的特异性。而含有探针的荧光PCR虽然特异性强，但是具有设计困难、成本大、不适合高度变异的基因检测等缺点。到本专利申请时起，本专利专利技术人检索到一些利用含有探针的荧光PCR来建立检测病毒毒力的技术的报道，但是没有检索任何利用不含探针的荧光PCR来建立检测病毒毒力的技术的报道。其原因可能是1)荧光PCR技术相对而言比较新，有关技术人员还没有深刻理解各种模式荧光PCR的长处和短处；2)有关技术人员没有设计出具体的路线来避免不含探针的荧光PCR的非特异性。参考文献韩俊英，曾瑞萍.荧光定量PCR技术及其应用.国外医学遗传学分册.2000年第23卷第3期117-120页.<作者>Gardner SN，Kuczmarski TA，Vitalis EA，Slezak TR.<文章名>Limitations ofTaqMan PCR for detecting divergent viral pathogens illustrated by hepatitis A，B，C，and E viruses and human immunodeficiency virus.<期刊名>Journal of ClinicalMicrobiology.2003年第41卷第6期第2417-2427页.<作者>Aldous EW，Collins MS，McGoldrick A，Alexander DJ.Rapid pathotyping ofNewcastle disease virus(NDV)using fluorogenic probes in a PCR assay.<期刊名>Veterinary Microbiology.2001年第80卷第3期第201-212页.3.
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题有以下几个(这几个问题是密切相关的)1)是如何建立一种简便的检测病毒毒力的方法？2)如何采用不含探针的荧光PCR检测病毒毒力，并且避免其非特异性？3)在用不含探针的荧光PCR检测新城疫病毒毒力时，其针对其弱毒毒株核酸序列特征的引物难以设计，那么如何设计出合适的针对新城疫病毒弱毒的核酸序列特征的引物？为了解决上述第一个问题，本专利技术采用不含探针的荧光PCR检测病毒毒力的技术方案。同已有的并且最为接近的技术方案，即采用含有探针的荧光PCR来建立检测病毒毒力相比，其有益效果是1)实施容易(不需要设计复杂的探针)；2)成本明显降低(不需要昂贵的荧光标记的探针)；3)更适合于高度变异的基因(病毒的毒力决定基因往往是高度变异的基因)。为了解决上述第二个问题，即如何采用不含探针的荧光PCR检测病毒毒力，并且避开其非特异性？本专利技术设计了具体的技术路线，即1)至少设计两套引物，其中一套或几套引物是针对强毒的核酸序列特征的，另外一套或几套引物是针对弱毒的核酸序列特征的。可以还设计一套或几套针对强毒和弱毒所共有的核酸序列特征的引物。每套引物包括上游和下游两条引物。上述各套引物可以共用某条引物。2)提取病毒核酸后，用这几套引物分别进行不含探针的荧光PCR，如果用针对强毒的核酸序列特征的一套或几套引物比用针对弱毒的核酸序列特征的一套或几套引物更有效地扩增病毒的核酸，则该病毒为强毒；反之，则为弱毒。如果被检病毒的核酸属于核糖核酸，在进行荧光聚合酶链式之前或同时，需要对其进行反转录。如果被检病毒的核酸属于脱氧核糖核酸，则无需反转录。总的说来，此路线和通常的荧光PCR判断结果的方式大不一样。它是通过比较两套或两套以上引物扩增效率来判断结果的，即通过阳性荧光信号出现早或迟的方式来判断结果。而通常的荧光PCR是通过有没有阳性荧光信号的方式来判断结果。几乎所有的非特异性的不含探针的荧光PCR扩增都出现阳性信号，但是其扩增效率都比较低，所以用本专利技术所采用的判断方式判断为阴性，而用通常的荧光PCR判断方式判断为阳性。因此，本专利技术所采用的方式大大减少了非特异性。此外本专利技术在设计引物时，要求Tm值均大于或等于63℃。我们在各种文献中没有见到Tm如此之高的引物用于病毒毒力的检测。引物Tm值很高的有益效果是可以提高荧光PCR的退火温度，从而从另一个层面大大提高检测的特异性。为了解决上述第三个问题，即如何设计出针对新城疫病毒弱毒的核酸序列特征的引物？本专利技术采用和模板序列不完全配对的方式来设计引物，从而避免引物形成难以打开的自身二聚体的结构。其有益效果是本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用不含探针的荧光ＰＣＲ来建立检测病毒毒力的技术，其特征是：１）检测对象为动物病毒或植物病毒的毒力；２）ＰＣＲ反应体系中没有探针（探针是指能够特异性结合被检测基因，但是不引导脱氧核糖核酸合成的一段单链脱氧核糖核酸），荧光物质要么直接加到反应体系中，要么标记在引物上（引物是指引导脱氧核糖核酸合成的单链脱氧核糖核酸）；３）在ＰＣＲ反应之前或同时可以有反转录的步骤，用来将ＲＮＡ模板转化为ＤＮＡ模板。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈继明，王志亮，弋英，
申请(专利权)人：农业部动物检疫所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]