设计并通过试验确认了一种新的ＰＣＲ技术。此技术被发明专利技术人命名为“同组ＰＣＲ”技术，它可以用来同时检测多种微生物。“同组ＰＣＲ”是一组ＰＣＲ反应，这一组ＰＣＲ反应中各个ＰＣＲ反应发生在不同的ＰＣＲ反应管中，但是各个ＰＣＲ反应都采用同一台ＰＣＲ仪器并共用同一个反应程序，甚至反应体系内除引物外其余成分都可一致，从而达到同时检测多种微生物的效果。此“同组ＰＣＲ”技术可以有普通的“同组ＰＣＲ”、“同组ＲＴ－ＰＣＲ”、“同组荧光ＰＣＲ”、“同组荧光ＲＴ－ＰＣＲ”、“同组梯度ＰＣＲ”、“同组梯度ＲＴ－ＰＣＲ”等多种形式。本发明专利技术以同时检测鸡禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉支气管炎病毒、鸡败血霉形体、鸡嗜血杆菌等鸡６种病原微生物为例，具体说明用“同组ＰＣＲ”技术同时检测多种微生物的过程。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物与医学领域，可以用于(但不限于)医学、兽医学和植物保护等基础或应用方面。2.
技术介绍
检测微生物具有重要的基础与应用价值。例如，检测医学病原微生物，如艾滋病毒，能够诊断艾滋病，或评价艾滋病人治疗的效果；检测兽医病原微生物，如禽流感病毒，能够诊断禽流感疫情；检测农作物的病原微生物，如水稻矮缩病毒，可以研究水稻矮缩病的防控措施。微生物的检测有多种技术。本专利技术所用的技术，追根溯源，是用PCR技术。PCR技术中文叫做聚合酶链式反应，它是通过特异的引物来检测各种微生物特有的核酸序列，并通过检测微生物特有的核酸序列来达到检测微生物的目的。现有的检测微生物的PCR技术绝大多数是一次操作只检测一种微生物，只有少数能同时检测多种微生物。这些少数同时检测多种微生物的PCR技术是在同一个PCR反应管中加上多对引物，每对引物对应不同的微生物，从而达到同时检测多种微生物的目的，这种方法叫做Multiplex PCR技术。MultiplexPCR技术可以通过跑核酸电泳来检测，也可以通过荧光信号来检测。它是和本专利技术最为接近的技术，但是和本专利技术又有许多不同。Multiplex PCR技术至少有2个不足之处1)用此方法同时检测的微生物的种类越多，它的反应体系内部的引物种类就越多，引物之间相互干扰性就越强，因而它能同时检测的微生物的种类非常有限，一般不超过4种；2)如果通过荧光信号来阅读检测结果，上述干扰性更为突出。本专利技术是以同时检测鸡禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉支气管炎病毒、鸡败血霉形体、鸡嗜血杆菌等鸡6种病原微生物为例，具体说明本专利技术具体实施过程。以前从未有过同时检测这6种病原微生物的实验室方法的报道，也从未有过用本专利技术所用的方法检测鸡病原微生物的报道。参考文献<作者>Dieffenbach CW，Dveksler GS.<书名>PCR PrimerA Laboratory Manual.<出版社>Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995年.<作者>Helps C，Reeves N，Egan K，Howard P，Harbour D.<期刊名>Detection ofChlamydophila felis and feline herpesvirus by multiplex real-time PCR analysis.Journal of Clinical Microbiology，2003年第41卷第6期第2734-2736页<作者>Beuret C.<题名>Simultaneous detection of enteric viruses by multiplexreal-time RT-PCR.<期刊名>Journal of Virological Methods，2004年第115卷第1期第1-8页.<作者>Stram Y，Kuznetzova L，Guini M，等.<题名>Detection and quantitation ofAkabane and Aino viruses by multiplex real-time reverse-transcriptase PCR.<期刊名>Journal of Virology Methods，2004年第116卷第2期第147-154页.3.
技术实现思路
为克服现有的PCR技术不能同时检测很多种微生物，以及难以用通过荧光信号来阅读检测结果的两个不足，本专利技术的专利技术人设计并通过试验确认了一种新的PCR技术。这项PCR技术被本专利技术人命名为“同组PCR”技术。它针对本专利技术的技术问题的解决方案是设计一组PCR反应，这一组PCR各个PCR反应发生在不同的管子中，因而不相互干扰；所要检测的各种微生物分别对应着这一组PCR反应中某一个或几个PCR反应，这一组PCR反应共用同一台PCR仪器和同一个反应程序，从而达到同时检测多种微生物的效果；各个PCR反应所扩增的产物在50bp-1000bp之间，使得既能够通过核酸电泳来阅读检测结果，也能够通过荧光信号来阅读检测结果。现在许多PCR仪器都有96个反应孔，如果一种微生物平均对应着两个PCR反应，每个PCR反应只需要占用PCR仪器上一个反应孔，那么在一个有96孔的PCR仪上按照上述“同组PCR技术”最多可以检测48种微生物。由于这一组共用同一台PCR仪器和同一个反应程序，所以在引物设计时受到一定的限制。例如，如果采用普通的PCR仪器，则理论上这一组PCR反应中各个PCR反应所用的引物Tm值应当大致相同，而且扩增产物的大小也大致相同，使得各个PCR反应可以共用同一个检测程序，甚至反应体系内除引物外其余成分都可一致；如果采用梯度PCR仪器，则这一组PCR反应中各个PCR反应所用的引物Tm值可以有一定的差异，但是各个PCR反应需要放在合适的位置上，使得各个PCR反应可以采用同一个反应程序。本专利技术的“同组PCR”技术有以下几种形式(并不局限于以下几种)。1)普通的同组PCR技术，特征是检测的核酸模板是DNA或由RNA转化而来的cDNA，它是各种形式的“同组PCR”技术的核心和基础。2)同组RT-PCR技术，特征是检测的核酸模板是RNA，它在PCR反应前进行反转录(英文缩写为“RT”)，将RNA转化为DNA，再进行PCR反应。3)荧光同组PCR技术，它的特征是用荧光信号检测PCR反应的结果，可以进一步细分为检测DNA的普通的荧光同组PCR技术和检测RNA的荧光同组RT-PCR技术。4)同组梯度PCR技术，它的特征是用梯度PCR仪器来操作，这一组PCR反应中各个PCR反应所用的程序不同，但是在某些环节中各个PCR反应的温度可以不同(即可以有一定的梯度)，此技术可以实际上放宽了同组PCR技术对引物的设计要求，但是每个PCR反应应当放在某一个确定的位置上。同组梯度PCR技术可以进一步细分为检测DNA的普通的同组梯度PCR技术和检测RNA的同组梯度RT-PCR技术。由于各种微生物，无论是基因组为DNA的微生物，还是基因组为RNA的微生物，其基因流动过程中都存在RNA这个阶段，因此理论上我们可以提取样品中的总RNA，通过上述同组RT-PCR技术达到检测各种微生物的目的。同组RT-PCR技术中RT和PCR两个步骤可以分开来操作，也可以并成一个步骤。如果分开来操作，利用随机引物进行RT可以制备同组PCR反应中各个反应都能共用的cDNA模板。与已有的并且最为接近的技术方案，即Multiplex PCR反应相比，同组PCR技术有益效果是1)它能同时检测很多种微生物，种类达到几十种以上；2)各种微生物的检测发生在不同的一个体系之内，相互没有干扰；3)可以通过荧光信号来阅读检测结果，并且通过荧光信号来阅读检测结果各个微生物检测体系仍然不相互干扰。4.具体实施方式下面以同时检测鸡本文档来自技高网...
【技术保护点】
用“同组ＰＣＲ”技术来建立同时检测多种微生物的技术，其特征是：１）检测反应实际包含一组ＰＣＲ反应，这一组ＰＣＲ反应中各个ＰＣＲ反应发生在不同的管子中，因而不相互干扰；２）所要检测的各种微生物分别对应着这一组ＰＣＲ反应中某一个或几个ＰＣＲ反应；３）各条引物设计恰当，使得这一组ＰＣＲ反应可以共用同一台ＰＣＲ仪器和同一个反应程序，甚至反应体系内除引物外其余成分都可一致；４）各个ＰＣＲ反应所扩增的产物在５０ｂｐ－１０００ｂｐ之间，使得既能够通过核酸电泳来阅读检测结果，也能够通过荧光信号来阅读检测结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈继明，王志亮，
申请(专利权)人：农业部动物检疫所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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