筛选猪的生长特异性基因的表达模式和以其制备的功能性cDNA芯片制造技术

本发明专利技术涉及筛选猪的生长特异性基因的表达模式和使用这些基因的功能性ｃＤＮＡ芯片，并提供了猪的肌肉和脂肪组织中与生长相关的新的生长因子的核苷酸序列。同时，本发明专利技术提供了一种用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性ｃＤＮＡ芯片，所述的ｃＤＮＡ芯片通过仅将由如上所述而得到的特异性基因整合于其中而制备。因此，所述的用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性ｃＤＮＡ芯片可用于改良猪的品质并培育新的品种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及筛选猪的生长特异性基因的表达模式和使用这些基因的功能性cDNA芯片。更为具体的，本专利技术涉及筛选生长特异性基因的表达模式，这些基因在生长阶段的猪的肌肉和脂肪组织中特异性地表达，本专利技术同时涉及一种用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片，所述的cDNA芯片通过仅将由所述筛选得到的特异性基因整合于其中而制备。
技术介绍
分子生物学的发展对家畜的遗传育种领域产生了巨大的影响，并由此在猪的基因连锁图谱(genetic linkage map)和数量性状基因座图谱(quantitative trait loci(QTL)map)研究上取得了极大的进展。特别是已经发现了与具有经济价值的性状相关的QTL的定位以及一些预期能够影响各种性状的候选基因，并已经将其直接应用于养猪业。目前，国际间正式的合作工作组例如PiGMaP(国际猪基因组图谱计划)协定图谱(Archibald等，1995)和USDA(美国农业部)基因图谱(Rohrer等，1994)已经在进行猪基因组的定位工作，基于1800个结合了基因的标记物，以构建基因连锁图谱(Archibald，1994；Marklund等，1996；Rohrer等，1996)。同时，最近已经开始进行积极的研究以鉴定与具有重要经济学价值的性状有关的DNA标记物(Nielsen等，1996)。构建猪的基因图谱是鉴定与定量的性状有关的特异性标记物的一个重要过程(Andersson等，1994；Archibald，1994；Schook等，1994)。基于猪的第6号染色体上的标记物与具有重要经济学价值的生长性状或畜体性状之间的关系，构建了一种基因连锁图谱(Clamp等，1992；Louis等，1994；Chevaletn等，1996)。需要改进的猪的性状包括每窝产子的数目、生长期的猪的生长速度、饲料的效率、畜体率的增加以及与背部脂肪厚度相关的精肉率。通常，每日体重的增加与饲料效率之间的遗传学相关系数很高，猪的生长率的提高可同时引起饲料效率的提高。例如，当饲料供应有限时，每日体重的增加的遗传率(heritability)为0.14至0.76，平均为0.30，而每日体重的增加与饲料效率之间的遗传学相关系数为-1.07至-0.93，平均为-1.0。因此注意到每日体重的增加与饲料效率之间存在很高的相关性。因此，每日体重的增加是反映成品猪(finishing pig)的体重增加性能的一个重要性状。迄今为止，对猪的遗传差异的检测采用了一些在mRNA水平对基因表达进行分析的技术，例如northern印迹、差异展示、基因表达的序列分析以及斑点杂交分析。不过，这些方法的缺点是不适于同时对多种表达产物进行分析。最近，开发出了能够克服此类缺陷的新技术如cDNA微阵列。cDNA微阵列成为了在各种活体进行基因表达研究的最有效的一种方法。该技术已经用于同时研究众多基因的表达和发现大量的基因，以及用于多态性的筛选和遗传性DNA克隆的定位。其同样是对由已知或未知基因转录产生的RNA进行定量分析的高度完善的RNA表达分析技术。目前正在使用的DNA芯片的类型包括通过设计基于数据库信息的引物并结合基于数据库信息的cDNA文库中的基因而构建的复合DNA芯片和通过结合基于现有文献的相关基因而构建的功能性DNA芯片。由于非相关基因的作用，当将复合DNA芯片转化为试剂用途时会遇到困难，且需要花费大量的工作才能最终解读基因的生物学作用。同时，由于其是基于数据库信息，其困难还在于缺乏新基因的信息或可能在一定程度上缺乏相关的基因。而功能性DNA芯片很容易转化为实际用途，但其需要收集基因以便鉴定那些在现有文献中尚未被描述或其功能尚未被了解的基因。因此，芯片上的DNA的构建对于其有效的实际应用是非常重要的。有鉴于此，本专利技术人将cDNA微阵列技术应用于筛选在猪的特定组织中与生长相关的基因的表达模式，并通过仅将由所述的筛而鉴定的特异性基因整合于其中而制备了一种功能性cDNA芯片，其可用于改良猪的品质，使其具有优良的生长特性，并用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析。
技术实现思路
因此，本专利技术的一个目的是通过将来自猪的肌肉和脂肪组织的靶DNA与一种整合了一种探针的底物进行杂交对生长相关性基因的表达模式进行筛选，所述探针由分离自猪的肌肉和脂肪组织的总RNA制备得到。本专利技术的另一个目的是提供一种用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片，该芯片通过仅将由筛选得到的特异性基因整合于其中而制备。根据本专利技术，上述目的可以通过以下步骤实现，通过PCR由分离自猪的肌肉和脂肪组织总RNA中制备得到的数千个EST，将其克隆以便在数据库中分析并筛选其核苷酸序列，通过PCR扩增这些EST，继而分离并纯化，用DNA芯片阵列将产物与对照组排列于玻片上，由分离自猪的肌肉和脂肪组织的总RNA中制备靶DNA以便对一种生长相关性基因表达模式进行筛选，将该靶DNA与玻片(探针DNA)继续杂交，对产物进行扫描以得到图象资料，基于该图象资料对猪的生长相关性基因的表达进行研究，并对该基因进行测序以确定该基因的核苷酸序列。并通过仅将猪的生长特异性基因整合于其中而制备一种功能性cDNA芯片。本专利技术包括以下步骤自猪的肌肉和脂肪组织制备EST并鉴定其序列信息；用所述的EST制备探针DNA；将一种荧光标记的、来自猪的肌肉和脂肪组织的靶DNA(EST)与该探针DNA杂交，继而对图象资料进行扫描和分析；研究一种生长相关性基因的表达模式；并通过仅将生长特异性基因整合于其中而制备一种功能性cDNA芯片。所述的根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片通过如下步骤而制备通过PCR由分离自猪的肌肉和脂肪组织的总RNA中制备4434个EST；将这些EST与一种酶对照物排列于DNA芯片阵列的玻片上；由分离自猪的肌肉和脂肪组织的总RNA中制备得到结合了3-dCTP或5-dCTP的靶DNA；将该玻片(探针DNA)与该靶DNA进行杂交，对产物进行扫描并分析图象资料以研究猪的生长相关性基因的表达；并通过仅将筛选得到的猪的生长特异性基因整合于其中而制备一种功能性cDNA芯片。本专利技术的根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片包含一种探针和所述探针固定于其上的基质，所述探针包含特异性表达于猪的肌肉和脂肪组织中的生长特异性基因。本专利技术的根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片的DNA微阵列上所固定的生长特异性基因包含如SEQ ID NO1至5所示的新的生长因子I、II、III、IV和V的核苷酸序列。本专利技术的功能性cDNA芯片的基质优选地是一种聚合物膜，例如硅氧烷晶片(silicone wafer)、玻璃、聚碳酸酯、膜、聚苯乙烯或聚亚安酯。本专利技术的DNA微阵列可通过采用制备DNA微阵列的常规方法将探针固定于基质上而制备，所述方法包括照相平版印刷(photolithography)、压电印刷(piezoelectric printing)、微量加样(micro pipetting)、点样等等。本专利技术采用的是点样方法。根据猪本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性ｃＤＮＡ芯片，其包括一种探针和所述探针固定于其上的基质，所述探针包含猪的肌肉和脂肪组织中的生长特异性基因。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：金哲旭，吕政秀，李正圭，宋瑛敏，曹光根，郑起和，金一锡，陈祥根，朴修贤，郑智媛，李旼晶，权银贞，赵恩锡，赵碻来，慎诜敏，南喜善，洪娟喜，洪星光，姜阳守，河永主，卢正晚，郭石俊，崔仁灏，金炳宇，
申请(专利权)人：庆尚南道，金哲旭，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]