含有根据猪生长阶段表达的脂肪特异性基因的功能cDNA芯片制造技术

本发明专利技术涉及根据猪的生长阶段来筛选脂肪特异性基因的表达谱，以及采用该表达谱构建的功能ｃＤＮＡ芯片，并且根据猪的肌肉和脂肪组织的生长阶段提供了脂肪特异性基因的表达谱。此外，本发明专利技术还提供了用于猪的肉质评价和筛选特异性基因的功能ｃＤＮＡ芯片，该芯片是通过仅仅整合上述筛选到的脂肪特异性基因而制备到的。因此，该功能ｃＤＮＡ芯片可用来根据猪的品种评价肉质，并培育高肉质的猪。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及筛选根据猪生长阶段表达的脂肪特异性基因的表达谱以及用该表达谱制造的功能cDNA芯片。尤其是，本专利技术涉及筛选在生长阶段的猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达的脂肪特异性基因表达谱以及用来评价肉的高质量以及筛选猪的特异性基因的功能cDNA芯片，该功能cDNA芯片采用仅仅整合脂肪特异性基因的方法制备得到。
技术介绍
由于原产的黑猪具有很厚的背部脂肪层，生长速度慢且繁殖率低，因此养猪的农民不愿意养这类猪。但是，这种猪具有结实的脂肪组织、白色的脂肪颜色、良好的质地、丰富且甜的肉汁，口感好，因此目前对这种猪肉的消耗量趋向于增加。可是，对这种原产猪的基因研究、谱系的保存和控制，以及肉质相关基因的分析仍然很不够。尤其是，与肉产量相关性状相比，肉质相关基因性状是更多基因特性综合的结果，这方面的研究尚未完全展开(Cameron，1993)。一些重要的基因影响猪的肉质，目前已知的有ryanodine受体基因(RYR)，它导致了PSE(苍白的，柔软的，渗出的)猪肉(Eikelenboom andMinkema，1974；Smith and Bampton，1977；Webb，1981；Christian andMabry，1989；Fujii el al.，1991)，以及酸肉基因(Rendement Napole，Le Royel al.，1990；Lundstrom el al.，1996)。此外，通过QTL(数量性状座)分析可以知道肉质相关区域或各种候选基因。已知存在于第7号染色体上的猪白细胞抗原(SLA)复合物(Geffrotin el al.，1984)以及围绕该区域的微卫星标记S0064，S0066，S0102或TNF与背部脂肪厚度、上部腰肉位置、肉质特性以及猪肉腐败相关(Jung el al.，1989；Rothschild el al.，1995；Bidanel elal.，1996)。并且，已经发现背部脂肪厚度和腹部脂肪含量相关的QTL位于微卫星标记S0001-S0175(Andersson el al.，1994)的位置。此外，已有报道，垂体特异性的转录因子(PIT1)基因是一种激素调节因子(Yu el al.，1995)。并且已知肌肉间的脂肪含量(IMF)能极大地影响肉嫩、肉汁和口感(Devol elal.，1988；Cameron，1990)。有报道HFAPB(心脏脂肪酸结合蛋白)基因能影响肌肉间的脂肪含量(Gerbens el al.，1997)。现在，位于第6号染色体上的微卫星SW1823至S0003(74至79cM)位置与肉的这些特性的相互关系已得到了研究(Grindflek el al.，2001)。因此，由于第4、6和7号染色体上大量发现了影响肉的质量性状的QTL(Clamp el al.，1992；Andersson el al.，1994；Renard el al.，1996；Rohrerand Keele 1998a，1998b；Wang el al.，1998；de Koning el al.，1999；Oviloel al.，2000；Gerbens el al.，2000)，已有许多研究围绕这些染色体开发了肉质相关标记。在过去的几年里，已经有研究尝试开发含有无名的猪肉质相关基因标记和已知标记的基因图谱。到现在，已有多种在mRNA水平分析基因表达的技术被用来分析猪的基因差异，例如northern印迹，差异展示、基因表达的顺序分析以及点印迹分析等。但是，这些方法的缺陷是不适合用于多种表达产品的同时分析。近来已发展出一项新技术如cDNA微阵列能够克服上述缺陷。cDNA微阵列已成为在各种活体上研究基因表达的最有力的方法之一。该技术用于多基因的同时表达，大规模地发现基因，以及用于基因DNA克隆的多态性筛选和图谱的制定。该技术用来对从已知或未知的基因中转录的RNA进行定量分析，是一种非常先进的RNA表达分析技术。目前使用的DNA芯片类型包括复合的DNA芯片，该DNA芯片的构建是通过设计引物，并根据数据库信息将来自cDNA文库的基因与功能DNA芯片结合，该功能DNA芯片是通过将现有文献中相关的基因结合而构建得到的。当复合的DNA芯片用于翻译时，由于非相关基因的作用而导致了翻译上的困难，因此需要很大的努力来最终解释生物学功能。并且，由于芯片的构建是基于数据库的，因此，没有信息或相关基因存在部分缺失的新基因可能就会有困难。同时，功能DNA芯片容易被翻译，但是需要另外收集基因用来表征那些在现有文件中未描述过的或功能未知的基因。因此，芯片上DNA的构建对于有效的解释生物功能是非常重要的。考虑到这些问题，本专利技术人引入了cDNA微阵列技术来筛选猪的特定组织中与肉质相关的基因表达谱，并通过仅仅整合筛选到的特定基因而制备功能cDNA芯片，该芯片可用于高肉质猪的改良，以及根据猪的品种和组织来评价肉质。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的在于根据脂肪的生长阶段筛选差异表达的特定基因的表达谱，这种筛选是通过将与探针整合的基底和来自猪的肌肉和脂肪组织的靶DNA杂交，其中探针是从猪的肌肉和脂肪组织中分离到的总RNA中制备而来的。本专利技术的另一个目的在于提供一种功能cDNA芯片，用于猪的肉质评价和筛选特定基因，该芯片是通过仅仅整合筛选到的特定基因而制备得到的。根据本专利技术，上述目的是通过下述步骤实现的首先，用PCR从总RNA中制备数以千计的ESTs，所述总RNA是从猪的肌肉和脂肪组织中分离到的，然后将ESTs克隆分析，并在数据库中筛选它们的核苷酸序列，用PCR扩增ESTs，接着分离纯化，使用DNA芯片阵列在载玻片上排列产物和对照组，从猪的肌肉和脂肪组织里分离到的总RNA中制备靶DNA，来筛选生长相关基因的表达谱，将载玻片(探针DNA)和靶DNA杂交，扫描产物以获得一个图像文件，根据图像文件上猪的生长阶段检测差异表达的脂肪相关基因的表达情况，并通过仅仅整合根据生长阶段的猪的脂肪特异性基因来制备功能cDNA芯片。本专利技术包含下述步骤从猪的肌肉和脂肪组织中制备ESTs以及鉴定序列信息；用ESTs制备探针DNA；将猪的肌肉和脂肪组织中获得的荧光标记的靶DNA(ESTs)与探针DNA杂交，接着扫描和分析图像文件；根据猪的生长阶段检测脂肪相关基因的表达谱；并通过仅仅整合脂肪特异性基因制备功能cDNA。用于猪的肉质评价和特异性基因筛选的功能cDNA芯片是由下述步骤制备的从猪的肌肉和脂肪组织中分离到总RNA，用PCR从分离到的总RNA制备4434 ESTs；用DNA芯片阵列在载玻片上排列ESTs和酶对照；从猪的肌肉和脂肪组织分离到的总RNA中制备具有3-dCTP和5-dCTP结合的靶DNA；将载玻片(探针DNA)与靶DNA杂交，扫描产物并分析图像，以便根据猪的生长阶段检测特异性表达的脂肪相关基因的表达情况；并通过仅仅整合筛选到的猪生长阶段的脂肪特异性基因来制备功能cDNA芯片。根据本专利技术的用于猪的肉质评价和特异性基因筛选的功能cDNA芯片包含探针和固定探针的基底，该探针含有在猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达的脂肪特异性基因。根据本专利技术，用于猪的肉质评价和特异性基因筛选的功能cDNA芯片的DNA微阵列上所固定的探针DNA包含胶原蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于肉质评价和筛选特异性基因的功能ｃＤＮＡ芯片，该芯片包括含有脂肪特异性基因的ＤＮＡ探针和固定探针的基底，其中脂肪特异性基因是在猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：金哲旭，吕政秀，李正圭，宋瑛敏，曹光根，郑起和，金一锡，阵祥根，朴修贤，郑智媛，李旼晶，权银贞，赵恩锡，赵碻来，慎诜敏，南喜善，洪娟喜，洪星光，姜阳守，河永主，卢正晚，郭石俊，崔仁灏，金炳宇，
申请(专利权)人：庆尚南道，金哲旭，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]