本发明专利技术涉及分析导致家族性高胆固醇血症的突变的存在或缺乏的体外方法。本发明专利技术方法描述这样的途径，其中可以使用来自个体的ＤＮＡ样品检测所述突变，并且该方法包括下列：使用与低密度脂蛋白受体基因互补的引物进行聚合酶链式反应；通过测序分析扩增的产物；限制性酶切分析；单链构象多态性技术；可以用于检测前述ＤＮＡ中的突变的异源双链分析以及在生物芯片玻璃支持体上的装置的分析，在所述生物芯片玻璃支持体上排列有寡核苷酸探针。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对“离体”生物样品部分进行体外诊断以确定个体的称为家族性胆固醇血症的疾病的诱因的技术。
技术介绍
按照WHO的定义，动脉粥样硬化是由脂质和络合物的病灶性累积所导致的动脉血管内膜中变化的组合，伴随纤维状组织形成、钙化作用并且依次与介质中的变化关联。可以将动脉粥样硬化认为是在动脉壁中具有病原性显著脂质沉积物的动脉硬化的特殊形式。动脉硬化的大多数形式包括脉管壁的脂肪退化，可以将术语“动脉硬化”和“动脉粥样硬化”同义使用(Assmann G.在“LipidMetabolism and Atherosclerosis”Schattauer Verlag GMbH，Stuttgart 19821中)。脂质在水溶液中是不可溶的。脂蛋白是能够在血液中运输脂质的颗粒。取决于通过超速离心能够分离它们的方式，按照它们的密度将脂蛋白分成各种类别(Havel RJ等，J Clin Invest 1955，341345)。低密度脂蛋白(LDL)(d＝1.019-1.063g/ml)在血液中运输大量胆固醇。它们由大约75％的脂质(主要是胆固醇、胆固醇脂和磷脂)组成，血液中大约70％的总胆固醇是通过LDL颗粒进行运输的。将高胆固醇血症用于反应特殊群体的高于正常水平的血浆胆固醇的升高，并且其是动脉粥样硬化的发作和进展的一个关键因素。在西方社会，超过半数的死亡与动脉粥样硬化心血管疾病有关(Murray CJL和LopezAD.Lancet 1997；3491269-1276)。家族性高胆固醇血症(FH)是一类在LDL受体基因(LDL-r)中产生的常染色体显性遗传疾病，该基因编码容许LDL的胞内吸收和降解的蛋白质(Goldstein JL，Brown MS AnnRev Cell Biol 1985；11-39)。FH的几乎100％的外显率意味着受疾病侵袭的父母的后代的半数从出生开始具有严重提高的血浆胆固醇水平，男性和女性同样地受影响(Goldstein JL，Brown MS.The metabolic basis of inherited disease.Scriver CR，Beaudet AL，Sly WS，Valle D编辑。McGraw Hill New York第六版，1989；1215-1250)。受FH侵袭的个体显示脂性角膜弓、腱黄瘤和早发性症状的冠心病(Scientific Steering Committee on behalf of the Simon Broome register Group.Atherosclerosis 1999；142105-115)。FH是最常见的遗传疾病之一，并且估计杂合子患者和纯合子患者的频率分别为1/500和1/1,000,000。由于建立者效应，某些群体，诸如小量突变占优势，并且因此杂合的FH的频率更高，这些群体包括法国的法裔加拿大人(LeitersdorfE等J ClinInvest 1990；851014-1023)，信奉基督教的黎巴嫩人(Lehrman MA等JBiol Chem 1987；262401-410)德鲁兹(Landsberger D等Am J Hum Genet1992；50427-433)芬兰人(Koivisto UM等J Clin Invest 1992；90219-228)南非的欧洲血统的南非人(Afrikaner)(Kotze MJ等Ann Hum Genet 1991；55115-121)，以及立陶宛血统的德系犹太人(Meiner V等Am J Hum Genet1991；49443-449)，他们具有这样的特性，即作为建立者效应的结果，他们仅有几个突变是造成FH的原因，并且因此在那些群体中杂合的FH的频率要高于在其它群体中所估计的。FH杂合的患者显示非常高的血浆胆固醇浓度，通过高于95th百分点的值。在患有FH的患者中，年龄-标准化和性别-标准化的致死率要四倍-五倍高于在一般群体中的致死率(Scientific Steering Committee on behalf of theSimon Broome Register Group.Atherosclerosis 1999；142105-115)。将已经在LDL-r基因座上遗传了两个突变的患者称为“FH纯和子”或“FH双重杂合子”，在该情形中它们实际上不是导致在血浆中的LDL-c水平超出正常水平6-8倍提高的功能性受体。在大多数这些患者中，冠心病典型地发生在20岁之前(Goldstein JL等N Engl J Med 1983；309288-296)。如果能够在他们发展有症状的疾病之前诊断出具有杂合或纯合的FH的个体，可以对他们进行预防性地治疗以实质地减少他们心肌梗塞的风险。所述LDL-r是普遍存在的839个氨基酸的跨膜糖蛋白，其通过胞吞作用调节LDL向细胞中的运输(Goldstein J和Brown M J Biol Chem 1974；2495153-5162)(附图说明图1)。LDL-r基因位于染色体19p13.1-13.3的短臂上(Yamamoto T等Cell1984；3927-38)，跨度为45,000碱基对(bp)。其包括18个外显子和17个内含子，它们编码成熟蛋白质的如下6个功能域信号肽、配体结合域、类表皮生长因子(EGF)前体、O-连接的糖、跨膜和胞质结构域(Sundhof T等Science 1985；228893-895)(图2)。LDL-r的合成由复杂的反馈机制所调节，所述反馈机制响应胞内甾醇浓度的变化和细胞对胆固醇的需要而控制LDL-r基因的转录(Sudhof TC等J Biol Chem 1987；26210773-10779)。LDL-r基因的转录调节所需的DNA基序位于177bp的近侧启动子中(Sudhof TC等J Biol Chem 1987；26210773-10779)。该区域包含基础表达和甾醇调节的所有顺式-作用元件，并且包括三个每个为16bp的不完全的同向重复序列。重复序列1和3包含转录因子Sp1的结合部位并且是产生所述基因的基础表达所必须的，但是对于完全表达，需要重复序列2的参与(Dawson PA等J Biol Chem 1988；263；3372-3379)。重复序列2包含10bp的调节元件，SRE-1，(Smith JR等J BiolChem 1990；2652306-2310)，当胞内甾醇浓度减少时，其容许称作SREBP-1的转录因子的结合。到目前为止，已经绘制了LDL基因受体的转录调节元件的一些天然存在的突变的图谱(Hobbs HH，等Hum Mutat 1992；1445-466；Koivisto UM，等ProcNatl Acad Sci USA，1994；9110526-10530)，Mozas P，等J Lipid Res 2002；4313-18，http.//www.ucl.ac.uk/fh；http.//www.umd.necker.fr)。外显子1编码具有21个氨基酸序列的信号肽，其在转运到内质网的过程中从蛋白质上裂解下来。已经描述了一些在该外显子中的移码、错义突变和无义突变(http.//w本文档来自技高网...
【技术保护点】
应用于家族性高胆固醇血症的体外诊断方法的相应于ＳＥＱＩＤＮＯ：１的遗传序列，所述遗传序列包括下列突变的至少一个：（－２３）Ａ＞Ｃ，１０５４ｄｅｌ１１，１０８ｄｅｌＣ，１１９７ｄｅｌ９，１２０７ｄｅｌＴ，１４３２ｄｅｌＧ，１９１－２ｄ ｅｌＡｉｎｓＣＴ，２１８４ｄｅｌＧ，２３１ｄｅｌＣ，２３９９ｄｅｌ５ｉｎｓ４，３１３＋ｌｉｎｓＴ，３３８ｄｅｌ１６，５０９ｉｎｓＣ，６７５ｄｅｌ１５，６８４ｄｕｐ１２，９４１－３９＞Ｔ，Ｃ１９５Ｒ，Ｃ２５５Ｇ，Ｃ３１９Ｙ，Ｄ１５７Ｇ，Ｄ ６３０Ｎ，Ｅ２９１Ｘ，Ｈ６３５Ｎ，Ｎ５９Ｋ，Ｔ４１Ｍ，Ｗ５１５Ｘ，Ｙ３７９Ｘ，Ｙ４２１Ｘ，Ｔ４３３Ｎ，８１８ｄｅｌ８，１４２３ｄｅｌＧＣ／ｉｎｓＡ，１２０４ｉｎｓＴ，４５１ｄｅｌ３，Ｇ５１６Ｘ，２３８９＋４Ａ＞Ｇ，１８１５ｄｅｌ１１，１１８６＋５Ｇ＞Ａ，Ｔ７４０Ｍ，Ｉ７７１Ｔ，Ｒ２７９Ｇ，Ｔ４４６Ｉ，Ｈ５６２Ｑ，Ｃ７４Ｙ，Ｄ６８６Ｙ，Ｇ（－２）Ｒ，Ｅ５７９Ｄ，Ｓ２０５Ｃ，Ｄ２００Ｖ，Ｖ７６６Ｅ，Ｌ（－６）Ｐ，２５４４ｉｎｓＣ，Ｃ４２Ｙ，２３８９＋３Ａ＞Ｃ，［１５８７－５ｄｅｌ５；１５８７ｄｅｌ３１］。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：P马塔洛佩兹，RA阿隆索卡尔列兹，P莫萨斯阿隆索，G雷耶斯莱亚尔，M波科维米耶拉斯，S卡斯蒂略费尔南德斯，D特赫多尔埃尔南德斯，A马丁内斯马丁内斯，M马连佩雷斯，
申请(专利权)人：拉塞有限公司，
类型：发明
国别省市：ES[西班牙]
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