一种用转基因植物表达医用蛋白的方法技术

技术领域：基因工程领域本发明专利技术要解决如何在植物体特定组织中表达医用蛋白，提高医用蛋白表达量，并保证医用蛋白免疫活性的问题。本发明专利技术以防治Ｈｐ感染为例，采用植物生物反应器原理，将与Ｈｐ免疫原性相关Ｈｐ　　ｃａｇＡ或ｕｒｅＢ和粘膜免疫佐剂ＣＴＢ融合基因转入水稻基因组中，并利用特异表达启动子使在转基因水稻籽粒中大量、稳定表达，通过品种选育和蒙古沙鼠免疫试验，获得含有高免疫活性医用蛋白的转基因水稻，作为防治Ｈｐ感染的疫苗来源。今后，人们尤其是高危人群，在医生指导下，食用一定量的功能性大米或其制品，以达到根治和预防Ｈｐ感染、降低Ｈｐ相关性疾病的发病率、增强预防胃癌能力的目的。

【技术实现步骤摘要】

基因工程领域
技术介绍
1，植物生物反应器是国际生物工程药物研究的前沿领域。通过转基因技术，以农作物为表达系统生产试剂和药物、单克隆抗体、酶制剂和结构蛋白、抗原(疫苗)等，安全廉价，与微生物和转基因动物相比，具有明显的优越性。80年代提出利用转基因植物生产人类所需要的各种药物原料的分子农业(molecular farming)的概念，目前部分产品已经上市并赢利。1995年《Science》发表利用转基因植物生产口服疫苗的设想。植物生物反应器打破了传统的医药生产模式，开创了生物医药工程学和植物基因工程交叉的新领域，具有良好的产业化前景。2，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是广泛感染于人类消化道的微需氧菌，已确认是慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因子，并被WHO列为与胃癌发生密切相关的病原菌，认为是人类第I类致癌原(Group I carcinogen)。由于常规药物治疗存在副作用大，耐药菌株逐渐增多等缺点。因此，疫苗的使用将是预防Hp感染的最有效方法。幽门螺杆菌基因工程疫苗一直是国内外研究的热点，但迄今尚无产品问世。通过转基因技术，用植物作为生物反应器大量生产廉价、安全的口服Hp疫苗不仅具有较高的科研价值，而且具有巨大的经济效益和社会效益。Hp存在多种保护性抗原，如尿素酶(urease)、细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin assiociated protein，CagA)、空泡毒素A(vaculoting cytotoxinA，VacA)等，其中尿素酶主要活性部位存在于细菌表面，表达量高且高度保守，尿素酶B亚单位因具有无毒性和很强的免疫原性，而成为Hp疫苗有效成份的候选者。霍乱毒素B亚单位(CTB)是霍乱毒素(CT)的免疫原部分，霍乱毒素及其B亚单位是迄今为止发现的最强的、能刺激机体粘膜反应的免疫原。据文献报道，以CTB为免疫佐剂配合Hp相关抗原口服免疫蒙古沙鼠，能使其产生针对Hp感染的保护性免疫。3，我国是慢性胃疾病的高发国家，胃癌位居我国恶性肿瘤死亡的前列，因此，预防和根治Hp感染对大幅度降低慢性胃病及胃癌的发生，保护人民身体健康具有极其重要的意义。病理学研究表明，细胞毒素相关蛋白A(Cag A)是Hp菌株具有高毒力的标志。Cag A蛋白具有免疫保护作用，是Hp重要的保护性蛋白抗原。但是目前还无法人工培养Hp和制备防治Hp的免疫药物。本专利技术采用植物生物反应器的原理，以农杆菌Ti质粒为载体，将外源基因Hp cagA或ureB基因和粘膜免疫佐剂CTB融合基因转入水稻基因组中，使转基因植物大量、稳定表达Hp的CagA或ureB蛋白抗原，在蒙古沙鼠模型中验证其防治Hp感染的作用。
技术实现思路
以防治Hp感染为例，将与Hp免疫原性相关基因导入水稻，并利用特异表达启动子使基因在水稻籽粒中表达，通过选育和蒙古沙鼠免疫试验，获得具有能够表达免疫活性医用蛋白的水稻品系。●构建不含抗生素选择标记的高效、特异和安全的表达载体。●攻克植物生物反应器的关键技术，建立了功能性作物的技术平台。●研究目的基因表达产物(免疫蛋白含量)随世代和环境变化的规律。●选育具有较高免疫活性的株系进行生产技术的公关。具体实施例方式实施例1以通过农杆菌介导法将CagA和CTB融合基因导入水稻为例。本实施例不排除其它的试验方法和措施，包括试验材料等。一、表达载体的构建1.根据genebank中公布的CagA以及CTB基因的序列分别设计引物CagA-F 5-’CGCGAGGATCCATGACTAACGAAACTATTGA-3’(BamHI)；CagA-R 5-′GCGACGGtaCCTTAAGATTTTTGGAAACCAC-3′(KpnI)；CTB-F 5-’CGGCGGGTACCATGATTAAATTAAAATTTGG-3’(KpnI)；CTB-F 5-’CGGCGGGTACCATGATTAAATTAAAATTTGG-3’(KpnI)；CTB-R 5-’GGATACTCGAGGGATCCTTAATTTGCCATACTAATTG-3’(XhoI，BamHI)。CTB-R 5-’GGATACTCGAGGGATCCTTAATTTGCCATACTAATTG-3’(XhoI，BamHI)。从H.pylori DS115DNA中扩增CagA和CTB基因的全序列。为下一步克隆方便，在各引物的5’端设计酶切位点。2.BamH+KpnI双酶切CagA基因纯化片段和中间载体pbluescriptII KS(+)，回收约3.4kb的CagA基因片断及约3kb的中间载体pbluescriptII KS(+)片断，定量按3∶1的比例将两个片断混和进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌。挑取重组菌株，提取质粒酶切鉴定。得到重组中间质粒KS-CagA。3.KpnI+XhoI双酶切CTB基因纯化片断和质粒KS-CagA，回收约400bp的CTB基因片断及约6.4kb的KS-CagA质粒片断，定量按3∶1的比例将两个片断混和进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌。挑取重组菌株，提取质粒酶切鉴定。得到含有CagA-CTB串连基因的重组中间质粒KS-CagA-CTB。4.BamHI单酶切中间载体KS-CagA-CTB和经改造的pCAMBIA1301双元载体，回收约3.8kb的CagA-CTB串连基因片断和约12kb的pCAMBIA1301双元载体片断，将pCAMBIA1301双元载体片断进行去磷酸化，定量按3∶1的比例将两个片断混和进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌。挑取重组菌株，提取质粒酶切鉴定。最终得到可用于农杆菌介导转化植物的双元表达载体p1301-CagA-CTB。二、农杆菌感受态细胞的制备取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平、卡那霉素平板上划线，28℃培养。挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16hr。取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600＝0.5。转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清液。加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，去上清。加入4ml预冷的含15％甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。三、双元载体转化农杆菌EHA105取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min。再在37℃水浴5min或42℃水浴lmin，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml卡那霉素的YM平板上。28℃培养到形成单菌落。也可以将上述双元载体质粒DNA用电激法导入EHA105感受态细胞，28℃培养到形成单菌落。挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的YM液体培养基中，28℃，220rpm摇培16hr，直接用菌液进行PCR鉴定。四、根癌农杆菌介导的水稻转化准备开花后12-15天左右的脆茎水稻未成熟种子，经表面灭菌后挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基(NB)上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用转基因植物表达医用蛋白的方法，其特征是以防治Ｈｐ感染为例，将与Ｈｐ免疫原性相关基因导入水稻，并利用特异表达启动子使基因在水稻籽粒中表达，通过品种选育和蒙古沙鼠免疫试验，获得具有能够表达免疫活性医用蛋白的水稻。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡国成，付亚萍，孙宗修，刘文真，斯华敏，
申请(专利权)人：胡国成，付亚萍，孙宗修，刘文真，斯华敏，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]