快速分析抗肿瘤中药分子毒理的中药毒理芯片及其方法技术

快速分析抗肿瘤中药分子毒理的中药毒理芯片及其方法，它属于生物技术领域。为了突破以往药物毒理研究中单基因的模式，实现快速、高通量的检测抗肿瘤中药的分子毒理，本发明专利技术的中药毒理芯片所涉及到的基因包括凋亡、细胞周期调控、药物转化代谢、ＤＮＡ复制与修复等，分析抗肿瘤中药分子毒理的方法为：选择抗肿瘤中药作为工具药物，肿瘤细胞株作为细胞模型，用工具药物分别作用细胞模型后，筛选出各工具药物相应的敏感细胞系，检测药物作用的基因，应用生物信息学对药物的毒理表达图谱进行信息统计和分析，依据特异性毒理相关基因的变化规律，进行分子细胞水平的毒理验证。本发明专利技术可缩短药物研究开发周期及减少药物研究开发费用，加快中药进入国际市场。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速分析抗肿瘤中药分子毒理的基因芯片及其方法。
技术介绍
由于中药的作用机理是复杂的，在传统意义上讲是通过调节机体的整体功能而起治疗作用。利用传统药理毒理研究方法，对中药从整体、器官、细胞乃至分子水平很难进行较全面的评价。在中药提取物作用于动物的前后阶段，利用基因芯片技术将动物特定的细胞中相关功能基因表达差异变化进行对比，或许能够了解该中药在研究剂量下是否有细胞毒及产生毒性的作用。研究发现，借助现代基因表达谱检测技术研究中药的细胞毒性，就能在基因转录表达水平上进行准确、快速、高效的筛选与安全性评价，使得能在分子水平上了解细胞毒性的作用靶点及方式、代谢途径。可见，这方面的思路和研究方法对阐明中药的作用机制和中药毒性的评价等有重要意义，可为推动中药研究的国际化进程，找出有说服力的“共同语言”。基因芯片在中药领域的运用将为准确、快速、高效地评价中药复方及其中成药物是否有毒提供有效的手段。以往药物毒理研究主要集中在单基因模式上，单基因模式不能快速、高通量的检测抗肿瘤中药的分子毒理。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，突破以往药物毒理研究中单基因的模式，实现快速、高通量的检测新方法，可实现同时对多种与药物毒理有关的基因同时进行检测，从相关基因整体网络水平上研究中药的毒副作用，进行中药的安全性(毒性)评价。本专利技术的快速分析抗肿瘤中药分子毒理的中药毒理芯片由下述具有转录，细胞周期，凋亡相关蛋白，癌基因和肿瘤抑制基因，应激反应蛋白，RNA处理、周转和转运，细胞黏附受体蛋白，细胞信号传导，细胞外通讯蛋白，细胞受体，细胞骨架/迁移蛋白，膜通道和转运蛋白，代谢，细胞交通定位，翻译后修饰/蛋白折叠，翻译，蛋白周转，DNA结合及染色质蛋白，细胞外基质转运蛋白，和细胞内传导/效应/调节子生物学功能的基因片段组成。快速分析抗肿瘤中药分子毒理的方法按照下述步骤进行分析一、选用上述中药毒理芯片作为分析抗肿瘤中药分子毒理的DNA芯片；二、选择临床常规使用以及民间流行的抗肿瘤中药作为工具药物；三、选择常用的肿瘤细胞株作为细胞模型；四、用上述工具药物分别作用各种细胞模型后，筛选出各工具药物相应的敏感细胞系，提取mRNA，与中药毒理芯片杂交检测药物作用的基因；五、应用生物信息学对药物的毒理表达图谱进行信息统计和分析；六、依据特异性毒理相关基因的变化规律，进行分子细胞水平的毒理验证。本专利技术中所述抗肿瘤中药为亚砷酸注射液、紫杉醇注射液、寄生多肽、土槿皮酸、5，7，4-三羟异黄酮、大豆皂甙、大豆甾醇中的一种或几种；所述肿瘤细胞株为早幼细胞白血病HL-60、慢性髓细胞性白血病K-562、肝癌HepG2、胃腺癌BGC823、乳腺癌Bcap-37、卵巢癌HO8910、前列腺癌PC3、宫颈癌Hela中的一种或几种。本专利技术研制的中药毒理芯片(TOXICHIP)，它所涉及到的基因包括凋亡、细胞周期调控、药物转化代谢、DNA复制与修复等，可以自动、快速地检测那些可以影响药物效应的基因(如药物代谢酶、药物作用靶和致病因子的编码基因)和决定个人对药物毒性敏感性的基因。将DNA芯片技术应用于药物毒理学研究，一方面可以利用DNA芯片进行毒理表达谱的研究，以确认与药物效应及药物吸收、代谢、抗药性等相关的基因，并利用这些基因来评价药物的效果和不良反应；同时本专利技术的芯片上还包括了所有可能影响肿瘤病人对化学治疗反应的基因，借助这种芯片可以根据病人的基因型对病人分群，帮助医生为每个病人选择合适的治疗药物和药物剂量，并且可对由于不良反应而放弃的药物进行重新评价，选取可适用的患者群。在基因组学的基础上研究不同药物的毒理表达谱变化以便筛选高效低毒的药物，从而将药物的药效充分发挥而不良反应减少到最小是药物基因组学的研究方向。其优点为①在进入临床试验前，药物基因组学可以通过化合物对毒理表达谱的影响挑选先导物，从而降低由于药效的不稳定导致的失败几率。②在I期临床试验中，可以预见毒理表达谱造成的药物代谢动力学差异。③由于药物作用靶蛋白的差异反映在基因表达谱上，因此在II期临床试验中，由毒理表达谱可以预见药物造成的药效差异，由此来指导III期临床试验。根据TOXICHIP研究中药或其提取物作用于细胞后的基因表达谱的变化来研究其毒性，省时、省力，且可减轻对实验动物的依赖。虽然中药毒理芯片的工作刚刚起步，但是由于此技术可以省略大量的动物试验甚至临床，使药物副作用检测、药物抗药性测试的速度大大提高，成本大大降低，缩短药物筛选所用时间，提高效率，降低风险。另一方面DNA芯片利用药物基因组学的研究成果，根据人用药之后的基因表达谱变化将人分群，以实现药物基因组学研究的目的和价值。从这两方面足以看到DNA芯片技术对药物毒理基因组学研究的影响之大。本专利技术在国内外首次建立了以DNA芯片为核心的一种快速分析抗肿瘤中药分子毒理机制的系统，使大规模、高通量分析抗肿瘤中药的分子机理成为可能，它具有许多商用价值和科研价值，具体表现为(1)能够快速分析已知临床使用的中药以及民间秘方的分子毒理机制，可达到省时、省力，且可减轻对实验动物的依赖。(2)该系统能够作为一种商品，广泛应用于临床、医药行业以及实际生产中。(3)探明分子毒理作用机理，寻找到新的药物靶点，缩短药物研究开发周期及减少药物研究开发费用，加快中药进入国际市场。附图说明图1为染料木素对PC3细胞处理6小时的表达谱芯片荧光图。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式的快速分析抗肿瘤中药分子毒理的中药毒理芯片的基因类型、参数详见表1～2。具体实施方式二本实施方式中的中药毒理基因芯片(TOXICHIP)采用cDNA片段直接点样生产。cDNA片段由PCR扩增获得，并经过纯化、抽干，溶于含50％DMSO的点样缓冲液中进行点样，点样结束后通过紫外交联使cDNA固定于经特殊处理过的玻片上。点样时同时加入Amersham公司提供的质量控制基因，包括内参照标准基因和外参照标准基因，经12次重复点样分布于整个玻片的不同部位，上述两种参照与标记过程中加入的标准RNA相结合对整个芯片实验进行有效的质量控制，以使实验的效率、稳定性及实验结果的可重复性得到保障。选取已经体外实验证实确有活性并具有开发前景的化合物，利用来源清楚、病理分型明确且对药物敏感的人恶性肿瘤细胞株，在细胞培养板上用上述实验获得的药物IC50浓度处理相应肿瘤细胞系，然后用TOXICHIP基因芯片，优化的杂交技术检测药物作用下基因表达水平变化。具体步骤肿瘤细胞用中药相应的IC50浓度处理后，利用RNeasy RNA试剂盒提取处理前后的总RNA，通过紫外分光度计检测RNA的Ratio(比值)值。进一步利用Oligotex mRNA Midi试剂盒纯化分离mRNA，选取Cy3和Cy5为荧光物，进行后标记，利用紫外分光光度计检测标记效率。探针与杂交液(含50％甲酰胺)均匀混合，平铺于芯片表面，盖上Takara的芯片专用盖玻片，置于42℃避光水浴20小时进行杂交。取出杂交后的芯片，利用严谨的洗片方法进行后处理，自动化的洗片机保证芯片之间的差异程度降到最低。经过洗涤后的芯片立刻用Axon-4000A型扫描仪进行扫描，采集数据，获得药物对特定细胞株的毒理基因表达谱。根据生物信息学聚类分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速分析抗肿瘤中药分子毒理的中药毒理芯片，其特征在于所述中药毒理芯片由下述具有转录，细胞周期，凋亡相关蛋白，癌基因和肿瘤抑制基因，应激反应蛋白，ＲＮＡ处理、周转和转运，细胞黏附受体蛋白，细胞信号传导，细胞外通讯蛋白，细胞受体，细胞骨架／迁移蛋白，膜通道和转运蛋白，代谢，细胞交通定位，翻译后修饰／蛋白折叠，翻译，蛋白周转，ＤＮＡ结合及染色质蛋白，细胞外基质转运蛋白，和细胞内传导／效应／调节子生物学功能的基因片段组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩俊，李昌利，顾雪锋，李克深，闫作梅，于小丽，杨光，
申请(专利权)人：哈尔滨基太生物芯片开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]