以转基因方式生产的融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及一种转基因融合蛋白的生产方法。该方法包括下列步骤：提供一种包括可提供所述融合蛋白表达的转基因的转基因动物；使该转基因得到表达；和从所述转基因动物的乳中回收所述融合蛋白。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及以转基因方式生产的融合蛋白(例如免疫球蛋白-酶融合蛋白)、编码融合蛋白的核酸和融合蛋白和核酸的制备和使用方法。
技术介绍
正在开发越来越多的重组蛋白用于治疗和诊断的应用。然而，使用常规方法难以生产功能形式和/或所需量的许多这些蛋白质或生产它们的成本昂贵。常规方法包括将生产特定蛋白必不可少的基因插入诸如细菌、酵母或哺乳动物细胞、例如COS细胞这样的宿主细胞且然后使所述细胞在培养基中生长的步骤。接着所培养的细胞合成所需的蛋白质。传统的细菌或酵母系统不能够产生许多功能形式的复合蛋白。尽管哺乳动物细胞可以生产复合蛋白，但是它们一般难以生长且生长的成本昂贵、而通常仅产生mg/L量的蛋白质。使用细菌、酵母或哺乳动物系统的局限在诸如免疫球蛋白-酶融合蛋白这样的复合蛋白的生产中特别是如此，因为它们需要适当的翻译后修饰并装配成功能形式。专利技术概括本专利技术一般涉及转基因融合蛋白、例如免疫球蛋白-酶融合蛋白的生产方法。该方法包括下列步骤提供一种包括可为所述融合蛋白、例如免疫球蛋白-酶融合蛋白的表达提供的转基因的转基因动物、例如山羊或母牛；使该转基因得到表达；和优选从所述转基因动物的乳中回收所述融合蛋白。(尽管所述的实施方案涉及在乳中表达，但其它启动子、例如其它组织特异性启动子，例如肌肉、毛发、尿、血或卵特异性启动子也可用于在其它组织或产物中产生融合蛋白。)在一个优选的实施方案中，所述的转基因包括与第二种成分融合的第一种成分。所述的第一种成分可以包括靶向分子的亚单位、例如Ig亚单位、例如对肿瘤抗原(例如癌胚抗原(CEA)、转铁蛋白受体、TAG-72、表皮生长因子受体)具有特异性的Ig亚单位。所述的第二种成分可以是酶；非Ig亚单位的多肽；或其片段；RNA酶，例如RNA酶A、例如血管生成素；或羧肽酶B酶。在优选的实施方案中，由转基因哺乳动物、例如反刍动物、例如山羊或母牛的乳腺制备转基因融合蛋白。在优选的实施方案中，所述转基因融合蛋白分泌入转基因哺乳动物、例如反刍动物、例如产奶动物、例如山羊或母牛的乳中。在优选的实施方案中，所述的转基因融合蛋白分泌入转基因哺乳动物的奶，其浓度至少约为0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml或5mg/ml以上。在优选的实施方案中，在乳腺特异性启动子的调控下制备所述的转基因融合蛋白，所述的启动子例如乳特异性启动子、例如乳清蛋白启动子或酪蛋白启动子。乳特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子或乳清蛋白启动子。优选所述的启动子是山羊β酪蛋白启动子。在优选的实施方案中，所述的转基因融合蛋白具有下列通式R1-L-R2；R2-L-R1；R2-R1；或R1-R2，其中R1是免疫球蛋白部分；L是肽接头；且R2是酶部分。优选R1和R2共价连接、例如它们直接融合或通过肽接头连接。在优选的实施方案中，所述的转基因融合蛋白进一步包括指导融合蛋白分泌的信号序列、例如来自分泌蛋白的信号(例如来自分泌入乳的蛋白质的信号或免疫球蛋白信号)；和(可选的)编码分泌蛋白、例如分泌入乳的蛋白质或免疫球蛋白的氨基末端编码区的充足部分的序列，该部分足以使所述融合蛋白在例如转基因哺乳动物的乳中分泌。在优选的实施方案中，所述的融合蛋白包括单克隆抗体亚单位，例如人、鼠(例如小鼠)的单克隆抗体亚单位或其片段、例如其抗原结合片段。单克隆抗体亚单位或其抗原结合片段可以是单链多肽、重链和轻链的二聚体或两条重链和轻链的四聚体。优选所述的单克隆抗体是人抗体或其片段、例如其抗原结合片段。例如，人抗体可以由包括B细胞与永生化细胞融合的杂交瘤产生，所述的B细胞获自转基因的非人动物，例如转基因小鼠，它具有包括人重链转基因和轻链转基因的基因组。所述的抗体可以属于不同的同种型，包括IgG(例如IgGI、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA1、IgA2、IgA亚组、IgD或IgE。优选所述的抗体是IgG同种型。所述的抗体可以是全长的(例如IgG1或IgG4抗体)或仅包括抗原结合部分(例如Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段)。在优选的实施方案中，所述的融合蛋白的免疫球蛋白亚单位是一种重组抗体，例如嵌合或人源化抗体、亚单位或其抗原结合片段，例如它们带有来源于非人抗体(例如鼠)的可变区或至少是互补性决定区(CDR)，其中剩余部分来源于人。在优选的实施方案中，所述的融合蛋白的免疫球蛋白亚单位是单价的(例如它包括一对重链和轻链或其抗原结合部分)。在其它实施方案中，所述的融合蛋白是二价抗体(例如它包括两对重链和轻链或其抗原结合部分)。在优选的实施方案中，所述的转基因融合蛋白包括免疫球蛋白重链或其片段、例如其抗原结合片段。优选所述的免疫球蛋白重链或其片段(例如其抗原结合片段)与酶连接，例如通过肽接头与酶连接或直接与之融合。优选所述的免疫球蛋白重链-酶融合蛋白能够装配成功能性复合体、例如具有酶活性的二聚化、三聚化、四聚化或多聚化复合体。在优选的实施方案中，所述的转基因融合蛋白包括免疫球蛋白重链或其片段(例如其抗原结合片段)和轻链或其片段(例如其抗原结合片段)。优选所述的免疫球蛋白重链与酶连接，例如通过肽接头与酶连接或直接与之融合。优选所述的免疫球蛋白重链-酶融合蛋白能够装配成功能性复合体，例如具有酶活性的二聚化、三聚化、四聚化或多聚化复合体。在优选的实施方案中，所述融合蛋白中的酶是RNA酶，例如RNA酶A、例如血管生成素；或羧肽酶B酶。就诊断应用而言，所述的酶可以是辣根过氧化物酶。在一个优选的实施方案中，所述的转基因融合蛋白包括肽接头，且该肽接头具有下列特征中的一种或多种a)它使得免疫球蛋白和酶蛋白彼此相对旋转；b)它耐受蛋白酶的消化；c)它不与所述的免疫球蛋白或所述酶发生相互作用；d)它能使所述的融合蛋白形成保持酶活性的复合体(例如二聚化复合体、三聚化复合体、四聚化复合体或多聚化复合体)；和e)它促进所述融合蛋白折叠和/或装配成活性复合体。在一个优选的实施方案中所述的转基因融合蛋白包括肽接头，且该肽接头具有5-60个氨基酸的长度、更优选具有10-30个氨基酸长度；该肽接头的长度为20个氨基酸；该肽接头的长度为17个氨基酸；该肽接头中的每个氨基酸选自Gly、Ser、Asn、Thr和Ala组成的组；该肽接头包括Gly-Ser成分。在一个优选的实施方案中，所述的融合蛋白包括肽接头，且该肽接头包括具有通式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y的序列，其中y是1、2、3、4、5、6、7或8。优选所述的肽接头包括具有通式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3的序列。优选所述的肽接头包括具有通式((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro)的序列。在优选的实施方案中，所述的转基因融合蛋白装配成二聚体、三聚体、四聚体或四聚化以上的多聚化复合体。在优选的实施方案中，编码所述转基因融合蛋白的转基因是一种核酸构建体，它包括(a)可选的，绝缘子序列；(b)启动子，例如乳腺上皮特异性启动子、例如乳蛋白启动子；(c)编码可以指导融合蛋白分泌的信号序列的核苷酸序列，所述的信号序列例如来自乳特异性蛋白的信号；(d)可选的，编码分泌蛋白、例如分泌入乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因融合蛋白的生产方法，该方法包括下列步骤：提供一种包括可提供所述融合蛋白表达的转基因的转基因动物；使该转基因得到表达；和从所述转基因动物的乳中回收所述融合蛋白。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MD艾吉，D波洛克，Y艾切拉德，HM米德，SM莱伯克，
申请(专利权)人：GTC生物治疗学公司，阿斯特拉泽尼卡英国有限公司，由卫生与公众服务部代表的美利坚合众国政府，
类型：发明
国别省市：US[美国]