核酸检测用生物传感器识别元件及利用其构建的生物传感器检测核酸的方法技术

核酸检测用生物传感器识别元件及利用其构建的生物传感器检测核酸的方法，它涉及一种生物传感器识别元件及一种检测核酸的方法。本发明专利技术生物传感器识别元件以高纯碳化硅作为衬底，衬底上具有单分子层石墨烯结构。检测核酸的方法：A1、设计探针；A2、形成DNA双链；A3、探针固定；A4、测定核酸的浓度和突变情况。本发明专利技术方法通过对石墨烯表面的功能化处理，将探针分子共价连接在石墨烯表面，无需进行标记就可以实现对DNA的检测；并且，高品质的石墨烯识别元件对核酸的检测的灵敏度较高，制备和操作简单、稳定性好、响应速度快。

Detection of nucleic acid by biosensor element for nucleic acid detection and detection of nucleic acid by its constructed biosensor

【技术实现步骤摘要】
核酸检测用生物传感器识别元件及利用其构建的生物传感器检测核酸的方法
本专利技术涉及一种生物传感器识别元件及一种检测核酸的方法。
技术介绍
遗传检测在生物医学和农畜牧生产中具有重要的应用价值，被广泛应用于肿瘤的精准医疗、遗传疾病基因诊断和动物遗传育种中。现有的基因芯片和二代测序遗传检测方法存在价格昂贵、检测周期长、灵敏度低等问题，无法完全满足遗传检测的需求。基于碳纳米材料的核酸生物传感器具有无需标记，检测平台简单等优势，有极大的潜力，未来将成为解决肿瘤精准医疗动态等遗传检测问题的重要手段。荧光法石墨烯碳纳米材料核酸传感器对microRNA的检出限可以达到2.1fM和3.0fM，但是需要对探针进行荧光标记，限制了这一方法的应用。电化学法是近年来的研究热点，国内外多家课题组利用不同的碳纳米材料构建了电化学核酸传感器，均获得了极低的检出限。其中伊朗科学家以还原氧化石墨烯纳米墙为材料构建的电化学核酸传感器在检测DNA浓度和核酸单碱基多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)时，检出限分别达到了9.4zM和20zM(5和10个DNA分子/mL溶液)。证实碳纳米材料和电化学法在核酸检测中具有灵敏度的优势。
技术实现思路
本专利技术要解决现有基因芯片和二代测序遗传检测方法价格昂贵、检测周期长、灵敏度低等问题，而提供的一种核酸检测用生物传感器识别元件及利用其构建的生物传感器检测核酸的方法。本专利技术核酸检测用生物传感器识别元件以高纯碳化硅作为衬底，衬底上具有单分子层石墨烯结构。上述核酸检测用生物传感器识别元件的制备按以下步骤制备：步骤011、制备高纯SiC源料；步骤012、制备无微管SiC晶体；步骤013、切割制备4H晶型SiC衬底；步骤014、氢气刻蚀去除表面划痕；步骤015、在氢气刻蚀处理的SiC衬底表面制备单层石墨烯，即获得生物传感器识别元件。本专利技术核酸检测用生物传感器识别元件能可以直接换现有生物传感器上的识别元件构建生物传感器。采用上述核酸检测用生物传感器识别元件构建的生物传感器检测核酸的方法：步骤A1、根据待检核酸设计探针，探针序列为待检核酸的反向互补DNA序列并在5’端加一个C、A或G碱基，然后对探针序列5’端碱基进行氨基修饰；步骤A2、将探针核酸和扩增后的待检核酸分别溶解于PBS中，之后取等摩尔数混合，将混合液加热后置于室温缓慢冷却，退火形成DNA双链；步骤A3、生物传感器识别元件功能化处理、探针固定以及生物传感器识别元件表面的封闭；步骤A4、控制生物传感器识别元件表面温度，令生物传感器识别元件表面的探针与待检核酸形成双链，或者使形成的核酸双链发生解离，并测定生物传感器在此过程中的电流信号变化；再利用R语言分析获得的数据，并确定待检核酸的浓度和突变情况。其中，A31、生物传感器识别元件功能化处理：通过重氮反应功能化生物传感器识别元件表面；A32、将步骤A2形成的DNA双链共价偶联在识别元件表面。石墨烯(Graphene)是由单层碳原子紧密堆积成二维蜂窝状晶格结构的一种碳质新材料，是构建其它维度碳质新材料(如零维富勒烯、一维碳纳米管、三维石墨)的基本单元。作为一种新型的二维碳纳米材料，石墨烯以其独特而优异的电学、热学、力学等方面的性能，以及其超大表面积和独特的sp2键杂化结构使之成为构建生物传感器的优质候选材料。本专利技术以碳化硅为衬底，在其上生长石墨烯制成识别元件，并构筑生物传感器；设计合成DNA探针，将其固定于传感器识别元件表面，通过检测程序升降温过程中核酸双链形成与解离所引起的传感器电流变化来确定待检核酸浓度和突变情况，具有灵敏度高、准确高等优点。本专利技术方法通过对石墨烯表面的功能化处理，将探针分子共价连接在石墨烯表面，无需进行标记就可以实现对DNA的检测；并且，高品质的石墨烯识别元件对核酸的检测的灵敏度较高，制备和操作简单、稳定性好、响应速度快。附图说明图1是具体实施方式三所制备的核酸检测用生物传感器识别元件表面石墨烯的AFM形貌图。图2是具体实施方式三所制备的核酸检测用生物传感器识别元件表面石墨烯的拉曼衍射图。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式核酸检测用生物传感器识别元件以高纯碳化硅作为衬底，衬底上具有单分子层石墨烯结构。采用本专利技术制备的核酸检测用生物传感器识别元件构建核酸检测用生物传感器。本专利技术构建的核酸检测用生物传感器超敏感，检出限为100fM。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于：衬底为无微管、4H晶型SiC晶体。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。本实施方式核酸检测用生物传感器识别元件按以下步骤获得：步骤011、制备高纯SiC源料；步骤012、制备无微管SiC晶体；步骤013、切割制备4H晶型SiC衬底；步骤014、氢气刻蚀去除表面划痕；步骤015、在氢气刻蚀处理的SiC衬底表面制备单层石墨烯，即获得生物传感器识别元件。具体实施方式三：本实施方式核酸检测用生物传感器识别元件按以下步骤获得：步骤011、高纯碳和高纯硅颗粒放入坩埚中1920℃、真空加热合成高纯SiC源料；步骤012、将高纯SiC源料放入高频感应加热炉中调控生长系统内温场均匀分布，高纯SiC源料在温度为2200℃、精确度为1℃，炉腔内氩气压力为3000Pa、炉体加热功率为5000W，频率为10000Hz条件下晶体生长15个小时，获得SiC晶体；步骤013、沿SiC晶体c轴切割并化学机械抛光处理，获得4H晶型SiC衬底；步骤014、SiC衬底氢气刻蚀去除表面划痕；步骤015、在氢气刻蚀处理的SiC衬底表面制备单层石墨烯。本实施方式步骤011制备的高纯SiC源料中SiC的纯度高达99.99999％。本实施方式步骤012生长出的SiC晶体质量高、无微管。本实施方式步骤013沿SiC晶体c轴切割可将表面磨损降为最低沿晶体c轴切割(可将表面磨损降为最低)，并进行化学机械抛光处理。采用氢刻蚀工艺，去除表面衬底划痕。本实施方式步骤014氢气刻蚀在SiC衬底表面形成均匀有序、高度约为纳米量级的台阶状结构。本实施方式步骤015中将氢气刻蚀处理的SiC衬底放于高温反应炉内，在反应温度为1650℃、压力为5mbar、Ar气体流速控制为2L/min条件下加热生长时间为2小时，在SiC衬底表面生成单层石墨烯。石墨烯的表征如图1和图2所示，通过AFM显微镜获得的石墨烯表面形貌(图1)可以看出，本实施方式制得的石墨烯表面平整，缺陷度较少，具有完整的二维结构。石墨烯2D拉曼衍射的峰值在2720cm-1附近，而G峰在1600cm-1附近，G峰和2D峰的位置证明在SiC衬底上有石墨烯的存在，以G峰和2D峰的比值IG/I2D来判断石墨烯的厚度，根据图2计算出IG/I2D的值约为0.24，表明石墨烯为单层。具体实施方式四：本实施方式核酸检测用生物传感器识别元件构建的生物传感器检测核酸的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：步骤A1、根据待检核酸设计探针(P)，探针序列为待检核酸的反向互补DNA序列并在5’端加一个C、A或G碱基，然后对探针序列5’端碱基进行氨基修饰；步骤A2、将探针核酸和扩增后的待检核酸(T)分别溶解于PBS中，之后取等摩尔数混本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸检测用生物传感器识别元件，其特征在于该生物传感器识别元件以高纯碳化硅作为衬底，衬底上具有单分子层石墨烯结构。

【技术特征摘要】
1.核酸检测用生物传感器识别元件，其特征在于该生物传感器识别元件以高纯碳化硅作为衬底，衬底上具有单分子层石墨烯结构。2.根据权利要求1所述的核酸检测用生物传感器识别元件，其特征在于衬底为无微管、4H晶型SiC晶体。3.权利要求1所述核酸检测用生物传感器识别元件的制备方法，其特征在于按以下步骤获得：步骤011、制备高纯SiC源料；步骤012、制备无微管SiC晶体；步骤013、切割制备4H晶型SiC衬底；步骤014、氢气刻蚀去除表面划痕；步骤015、在氢气刻蚀处理的SiC衬底表面制备单层石墨烯，即获得生物传感器识别元件。4.采用权利要求1所述核酸检测用生物传感器识别元件构建的生物传感器检测核酸的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：步骤A1、根据待检核酸设计探针，探针序列为待检核酸的反向互补DNA序列并在5’端加一个C、A或G碱基，然后对探针序列5’端碱基进行氨基修饰；步骤A2、将探针核酸和扩增后的待检核酸分别溶解于PBS中，之后取等摩尔数混合，将混合液加热后置于室温缓慢冷却，退火形成DNA双链；步骤A3、生物传感器识别元件功能化处理、探针固定以及生物传感器识别元件表面的封闭；步骤A4、控制生物传感器识别元件表面温度，令生物传感器识别元件表面的探针与待检核酸形成双链，或者使形成的核酸双链发生解离，并测定生物传感器在此过程中的电流信号变化；再利用R语言分析获得的数据，并确定待检核酸的浓度和突变情况。其中，步骤A31、生物传感器识别元件功能化处理：通过重氮反应功能化生物传感器识别元件表面；步骤A32、将步骤A2形成的DNA双链共价偶联在识别元件表面。5.根据权利要求4所述的核酸检测用生物传感器识别元件构建的生物传感器检测核酸的方法，其特征在于步骤A31、将亚硝酸钠和对氨基苯甲酸混合后溶解于盐酸中，然后用反应生成的重氮盐溶液对石墨烯表面进行循环伏安扫描修饰，使重氮盐与识别元件表面的石墨烯形成碳碳共价双键。6.根据权利要求4所述的核酸检测用生物传感器识别元件构建的生物传感器检测核酸的方法，其特征在于步骤A3中用含有自由氨基的分子对生物传感器识别元件表面进行封闭。7.根据权利要求5所述的核酸检测用生物传感器识别元件构建的生物传感器检测核酸的方法，其特征在于步骤A31中盐酸的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L，对氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兆良，赵丽丽，宋爱利，
申请(专利权)人：哈尔滨烯芯科技有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23