蛋白质的生产制造技术

本发明专利技术提供了一种用培养具有表达载体的大肠杆菌生产蛋白质的改进的方法，该载体在转译起始密码子的下游具有蛋白质的结构基因，该方法包括在含有（１）铁离子，锰离子或其混合物和（２）天然来源的氮源的培养基中培养大肠杆菌以增加在Ｎ末端没有与转译起始密码子ＡＴＧ相对应的蛋氨酸的蛋白质产量．根据本发明专利技术的方法，可得到高产量的没有与转译起始密码子ＡＴＧ相对应的Ｎ末端蛋氨酸的蛋白质．（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及到生产蛋白质的方法。 各种生理活性蛋白质，象细胞素和肽类激素的存在已被证明，遗传工程技术上的最新进展已使得能够大规模生产这些生理活性蛋白质及将其用于临床。 白细胞介素-2〔下文中简写成IL-2;也叫T细胞生长因子(TCGF)〕是一种通过尤其是外源凝集素或异抗原刺激T细胞而产生的淋巴因子〔Science，193，1007(1976)〕。 利用IL-2，到目前为止已经获得了大量的杀伤T细胞或辅助T细胞以及天然杀伤细胞的无性系(例如Nature，268，154(1977)〕。除直接用于无性繁殖T细胞或天然杀伤细胞外，应用IL-2可导致在体外选择性增殖能识别并摧毁某种特定抗原，例如一种肿瘤抗原的专一抗原杀伤T细胞。将这样生长的肿瘤专一性杀伤T细胞引入动物体内能够控制或抑制肿瘤的生长〔The Journal of Immunology，125，1904(1980)〕。 这些试验的发现表明了IL-2作为一种抗肿瘤剂应用的可能性。进而得知IL-2重建了缺乏thumus功能的裸鼠辅助T细胞功能〔European Journal of Immunology，10，719，(1980)〕并恢复了杀伤T细胞对异源细胞的感应〔Nature，284，278(1980)〕，因此，IL-2有希望用于治疗免疫缺乏症。 干扰素-α〔下文简称IFN-α〕和干扰素-γ(下文简写为IFN-γ)是病毒或核酸激活的淋巴细胞产生的淋巴因子，它们具有作用于细胞并使之进入抗病毒状态的生物学活性，并因此在防御系统或肿瘤免疫系统中起重要作用。 象细胞素这样一类的蛋白质可象天然产生的一样获得，但数量非常有限。然而，重组DNA技术的最新成果已经开创了从大菌杆菌等的培养菌株中回收生物活性蛋白质的方法，这些菌株中分别携有上述蛋白质基因的表达载体〔对IL-2Nature，302，305(1983)和Nucleic Acids Research，11，4307(1983);对IFN-α，Journal of Interferon Research 1，381(1981);对IFN-γNature，295，503(1982)〕。 因为无论是在真核生物或原核生物中，蛋白质的生物合成起始于表达蛋氨酸的信使RNA密码子AUG，所以产物蛋白质可能是一种在N末端有蛋氨酸残基的分子或没有该残基的分子甚或两种分子的混合物。事实上已知在大肠杆菌中，许多细胞蛋白质的末端是蛋氨酸〔Conn & StumpfOutlines of Biochemistry，4th edition，John Wiley & Sous(1976)〕而且大肠杆菌的起始因子IF-3就含有N末端有蛋氨酸残基的分子和没有该残基的分子〔Hoppe-Seyler′s Zeitschrift für Physiologische Chemie，354，1415(1973)〕。说到用重组DNA技术在大肠杆菌中产生的蛋白质，已知对于IFN-α加入于N末端的蛋氨酸残基百分比大约是50%〔Journal of Interferon Research，1，381(1981)〕，而对于人生长激素则高达100%〔Nature，293，408(1981)〕。然而到目前为止，还没有在这些蛋白质中蛋氨酸残基加入百分比控制实例的报道。在他们的用植入了IL-2基因的大肠杆菌菌株生产IL-2蛋白质的方法的研究过程中;本专利技术者发现大肠杆菌产生的IL-2蛋白是由两种分子构成的，即N末端没有蛋氨酸残基的IL-2，这是一种以丙氨酸残基作为N末端氨基酸〔Ala-IL-2〕起始的分子，以及在N末端加入有蛋氨酸残基并因此以蛋氨酸丙氨酸残基〔Met-Ala-IL-2〕起始的分子，后者的含量比前者高得多。 类似的有，已发现大肠杆菌产生的IFN-α和IFN-γ的每一种都是N末端以半胱氨酸起始的分子〔分别为Cys-IFN-α和Cys-IFN-γ〕与N末端加入有蛋氨酸残基并因此以蛋氨酰半胱氨酸残基〔分别为Met-Cys-IFN-α和Met-Cys-IFN-γ〕起始的分子的混合物，后者占5-50%。 这些N末端具有蛋氨酸残基的蛋白质应该具有与天然类型的相应蛋白质相似的生物学活性，但无论如何是与后者不同的物质。因此，已知的方法在生产具有天然类型各自氨基酸序列的蛋白质方面不能完全令人满意。 本专利技术提供了通过培养具有表达载体的大肠杆菌生产蛋白质的改善方法，表达载体在转译起始密码子的下游含有该蛋白质的结构基因，该方法包括在含有(1)铁离子，锰离子或其混合物以及(2)天然来源的氮源的培养基中培养大肠杆菌增加N末端没有对应于转译起始密码子ATG的蛋氨酸的蛋白质产率。 对于上述蛋白质，可提及的有各种各样的生物活性蛋白质，例如象干扰素(例如IFN-α，IFN-β，IFN-γ)，白细胞介素(例如白细胞介素-I，IL-2)，B细胞生长因子(BGF)，B细胞分化因子(BDF)，巨噬细胞激活因子(MAF)，淋巴毒素(LT)以及肿瘤坏死因子(TNF)一类的细胞素;转化生长因子(TGF-α);肽蛋白质类激素，例如促红细胞生成素，表皮生长因子，胰岛素和人生长激素;病源微生物抗原蛋白，例如乙型肝炎病毒抗原，流感病毒抗原，口蹄疫病毒抗原和疟原虫抗原;酶类，例如肽酶〔组织血纤维蛋白溶酶原激活因子，尿激酶，肽裂解酶(Serratiopeptidase)〕和溶菌酶;以及血清蛋白质，例如人血清白蛋白(HSA)。 本专利技术方法可有效地应用于下述实例，在这些实例中，包括将IL-2，IFN-α和IFN-γ用通过培养某些大肠杆菌菌株而生产。 这里所说的IL-2指的是任何具有象天然人IL-2一样的生物学或免疫学活性的，诸如IL-2受体结合或抗-IL-2抗体结合功能的物质。例如，这种物质可能是一种具有图1所示氨基酸序列的多肽〔多肽(Ⅰ)〕或含有多肽(Ⅰ)的生物学或免疫学活性所必需的某个氨基酸序列部分的片段，例如多肽(Ⅰ)在其N末端少一个氨基酸〔EPC(laid open)No 91539〕或4个氨基酸(Japanese Patent Application No58-235638，filed on December 13，1983 and laid open under Japanes Patent Publication No 126088/1985)的片段或多肽(Ⅰ)在C末端位置少几个氨基酸的片段。而且，这种物质可能是一种多肽，它在其他方面与上述多肽(Ⅰ)是相同的，但是缺少多肽(Ⅰ)的组成氨基酸的一部分或含有一个或几个多肽(Ⅰ)起始发生的氨基酸以外的氨基酸，例如一种含有一个取代125号半胱氨酸残基的丝氨酸残基的多肽(Ⅰ)类似物〔Japanese Patent Publication(laid open)No 93093/1984〕。上述多肽最好是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产蛋白质的方法，培养具有一个表达载体的大肠杆菌，该载体在转译起始密码子下游有为该蛋白质编码的结构基因，该方法包括在含有（１）铁离子来源，锰离子来源或其混合物和（２）天然来源的氮源的培养基中培养大肠杆菌，增加在Ｎ末端没有与转译起始密码子ＡＴＧ相对应的蛋氨酸的蛋白质产量。

【技术特征摘要】
JP 1985-10-3 221517/85;JP 1986-3-3 45667/86;JP 1981、一种生产蛋白质的方法，培养具有一个表达载体的大肠杆菌，该载体在转译起始密码子下游有为该蛋白质编码的结构基因，该方法包括在含有(1)铁离子来源，锰离子来源或其混合物和(2)天然来源的氮源的培养基中培养大肠杆菌，增加在N末端没有与转译起始密码子ATG相对应的蛋氨酸的蛋白质产量。2、根据权项1的方法，其中的蛋白质是选自由细胞素，转化生长因子，肽蛋白激素，病原微生物抗原蛋白质，酶和血清蛋白质组成的一组生理活性蛋白质。3、根据权项2的方法，其中的细胞素是干扰素或白细胞介素。4、根据权项3的方法，其中的干扰素是干扰素α或干扰素β。5、根据权项3的方法，其中的白细胞介素是白细胞介素2。6、根据权项1的方法，其中的表达载体含有一启动子。7、根据权项6的方法，其中的启动子是λPL启动子。8、根据权项6的方法，其中的启动子是色氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：北野一昭，藤本茂，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]