制备胰高血糖素的方法技术

提供一种生产胰高血糖素的新方法。该方法包括制备由下式代表的融合蛋白质：Ｘ－ＧＬｕ－ＧＬｕｃａｇｏｎ＿＿＿＿（Ⅰ）其中Ｘ是有７０－１７０个氨基酸的先导顺序，ＧＬｕ是谷氨酸残基，且ＧＬｕｃａｇｏｎ代表胰高血糖素的氨基酸顺序，以及用能够在谷氨酸残基的羧基端特异地水解肽键的酶处理该融合蛋白质，从而裂解该融合蛋白质。（*该技术在2010年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及制备胰高血糖素融合蛋白质、然后用酶处理并回收以生产胰高血糖素的有效方法，还涉及该生产方法中使用的编码胰高血糖素的DNA顺序，含有该DNA顺序的表达载体，以及携带该表达载体的转化体。胰高血糖素(glucagon)是一种由胰岛A细胞分泌的肽激素，与胰岛B细胞分泌的胰岛素一起对碳水化合物代谢起着重要作用。胰高血糖素还是一种已知的高血糖-糖原分解因子(HGF);胰岛素可增进葡萄糖代谢并降低血葡萄糖水平，胰高血糖素则可使葡萄糖释入血中从而提高血糖水平。由于这些性质，故可使用胰高血糖素来试验生长激素的分泌、诊断胰岛瘤、进行糖元积聚试验、紧急治疗低血糖、在消化道的射线照相和内窥镜检查中作预处理及其他临床应用。胰高血糖素的氨基酸顺序是已知的;其分子是由29个氨基酸组成的单股肽链，氨基末端是组氨酸;羧基末端是苏氨酸(见附图说明图11)。人、猪和牛胰高血糖素的氨基酸顺序是一样的，因此工业上可由牛或猪胰腺中分离并提纯胰高血糖素。市场上可以买到以这种方法生产的胰高血糖素产品。再者，JamesW.White和GradyF.Saunders(NucleicAcidsResearch14，4719-4730，1986)已经阐明了编码胰高血糖素的人DNA顺序(见图11)。自此，人们已将注意力转向尝试用DNA重组技术经济地大量生产胰高血糖素。然而，如上所述，胰高血糖素是含29个氨基酸残基的短链肽，故分子量很低。当用DNA重组技术由宿主细胞分泌这种低分子量蛋白质时，它们将会被存在于宿主细胞内的蛋白水解酶降解。因此，如果使这种低分子量蛋白质与其他蛋白质结合成更为稳定的、有适当大小的融合蛋白质来表达，将是很有利的。这样，然后即可以用化学或酶方法处理这些融合蛋白质，分离出目的蛋白质。例如，日本专利公开63-284196号中介绍了一种以化学法处理融合蛋白然后回收目的蛋白质的方法。但化学处理常常伴有不利的付反应。另外，日本专利公开62-246600号描述了一种酶法处理融合蛋白以分离目的蛋白质的方法，其中是用谷氨酸特异性蛋白酶处理含表皮生长因子(EGF)的融合蛋白质，进而回收EGF这一目的产物。但已知EGF含有四个谷氨酸残基，因而使用这种酶难以回收到完整的EGF，而且收率很低。迄今为止，还没有一个经酶处理由融合蛋白中分离胰高血糖素的有效方法。本专利技术生产胰高血糖素的方法，克服了现有技术中的上述缺陷及其他许多缺点和不足，该方法包括制备通式(Ⅰ)所示的融合蛋白X-Glu+Glucagon(Ⅰ)其中X是70-170个氨基酸的先导顺序，Glu是谷氨酸残基，Glucagon代表胰高血糖素的氨基酸顺序，以及用能够在谷氨酸残基的羧基末端特异地水解肽键的酶处理所说的融合蛋白，以裂解该融合蛋白。在一优选方案中，用包括下列步骤的方法回收胰高血糖素(a).用适当的变性剂或表面活性剂溶解所说的融合蛋白质;(b).降低所说变性剂或表面活性剂的浓度;(c).向步骤(b)得到的混合物中加入酶，从而得到一种含有因融合蛋白部分分解而产生可溶性中间产物的反应混合物，(d).将所说的反应混合物除盐，得到含有所说的中间产物和酶，但不含有所说的变性剂和表面活性剂的部分，(e).借助含在所说部分中的酶使反应继续进行，以释放出胰高血糖素，以及(f).分离释放的胰高血糖素。本专利技术的表达载体具有编码上述融合蛋白的DNA顺序，并可在大肠杆菌宿主细胞中有效地表达所说的融合蛋白质。本专利技术的转化体是向大肠杆菌细胞内导入上述表达载体而得到的。本专利技术编码胰高血糖素的DNA顺序可用下式表示5′-CACTCTCAGGGTACCTTCACTTCCGACTACTCTAAATACCTGGACTCCCGTCGTGCTCAGGACTTCGTTCAGTGGCTGATGAACACC-3′(Ⅲ)本专利技术的纯化胰高血糖素，纯度达99%或更高，所说的纯度是用高效液相层析法测定的。因此，本专利技术可达到下述目的(1)提供一种生产胰高血糖素的方法，其中制备了含胰高血糖素的融合蛋白质，并以高效率用酶处理以回收胰高血糖素;(2)提供一种按上述方法使用小量酶，生产与天然产物相同之胰高血糖素的方法;(3)提供一个具有编码上述融合蛋白质之DNA顺序，并可使所说DNA顺序能在大肠杆菌中有效表达的表达载体，以及在其中导入了所说表达载体的转化体;(4)提供一个编码胰高血糖素的DNA顺序，该DNA顺序是由能以高频率出现于大肠杆菌中的密码子组成的;以及(5)提供纯度达99%或更高的纯化的胰高血糖素。可借助下列附图进一步了解本专利技术的目的及其优点，从而进一步理解本专利技术。图1显示了编码人胰高血糖素的DNA顺序。图2a是构建质粒pGAl的流程图，该质粒用于构建本专利技术的表达载体TrppAThuIFNγ/glucagon。图2b是构建质粒Trp pAT huIFN γ/Kallikr in的流程图，该质粒被用于构建本专利技术的表达载体Trp pAT huIFN γ/glucagon。图2c是构建本专利技术之表达载体TrppAThuIFNγ/glucagon的流程图。图3显示表达载体TrppAThuIFNγ/glucagon中含有的胰高血糖素DNA编码碱基顺序及该DNA上游和下游侧的相邻区域。图4a是构建质粒TrppAT△CyshuIFNγ的流程图，该质粒被用于构建本专利技术的表达载体TrppAT△CyshuIFNγ/glucagon。图4b是构建本专利技术之表达载体TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon的流程图。图5是构建本专利技术之表达载体TrppAT△Cys短huIFNγ/glucagon的流程图。图6是构建本专利技术之表达载体TrppAThuIFNα80A2/glucagon的流程图。图7a是用PCR方法合成含编码人IFNα80A2碱基顺序之DNA片段的流程图。图7b显示在构建本专利技术的表达载体TrppAT△CysⅡhuIFNγ/glucagon中，用PCR方法扩增编码胰高血糖素之基因顺序及其上游和下游DNA片段的流程图。图7c是构建本专利技术之表达载体TrppATCysⅡhuIFNγ/glucagon的流程图。图8显示人IFN80A2的DNA顺序和相应氨基酸顺序。图9a和9b显示对按本专利技术的DNA重组技术得到的胰高血糖素所作反相HPLC和离子交换HPLC分析的结果。图10a和10b显示对按本专利技术方法以DNA重组技术得到的胰高血糖素进行反相HPLC分析的结果。图10c显示对市售天然胰高血糖素进行反相HPLC分析的结果。图11显示人胰高血糖素的氨基酸顺序和编码所说胰高血糖素的人DNA顺序。在用本专利技术的方法制备融合蛋白质X-Glu-Glucagon时，可选择表现有高表达水平的氨基酸顺序作为以X代表的先导顺序。所选择的先导顺序X应是当将编码X的碱基顺序导入大肠杆菌(一种适用的宿主)以诱导表达时，所说融合蛋白质占总蛋白产生量的20%或更高，且所说的融合蛋白质在宿主细胞中形成颗粒(即包涵体)。X的适当分子量为10-20千道尔顿(相当于70-170个氨基酸)。对X的适当的特异性选择包括干扰素γ、△Cys-干扰素γ、干扰素α80A2、干扰素β、干扰素δ、白细胞间素1β、牛生长激素、β-半乳糖苷酶、人白细胞介素8、大肠杆菌丙酮酸激酶Ⅰ、氨基糖苷酶3′-磷酸转移酶(AP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备胰高血糖素的方法，其包括制备下式所示的融合蛋白质Ｘ—Ｇｌｕ—Ｇｌｕｃａｇｏｎ，（Ⅰ）其中Ｘ是７０—１７０个氨基酸的先导顺序，Ｇｌｕ是谷氨酸残基，Ｇｌｕｃａｇｏｎ代表胰高血糖素的氨基酸顺序，以及用可特异地水解谷氨酸残基 羟基端肽键的酶处理所说的融合蛋白质，以裂解所说的融合蛋白质。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：石崎顺，玉木幹男，新优，寺冈宏，吉田信男，续木博茂，
申请(专利权)人：盐野义制药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]