用重组DNA技术制备DNA.RNA.肽.多肽或蛋白质的方法技术

本发明专利技术涉及微生物生产肽或多肽的方法，可以在一种普通培养基中同时产生出至少有一部分是由随机合成多聚核甘酸组成的基因，将这样的基因导入宿主细胞，培养该宿主细胞以便无性繁殖那些随机基因并导致由其所表达的蛋白质的产生，对所需的宿主细胞转化体进行鉴别，筛选，分离，然后培养之，生产出所需的肽或多肽．（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术的目的是一种获得DNA、RNA、肽、多肽或蛋白质的程序，用含有能够表达这些RNA、肽、多肽或蛋白质的基因的转化的宿主细胞，即利用重组DNA技术实现。本专利技术的目的在于以一种可以同时获得的方式产生随机基因或随机基因碎片，这些基因转录和转译之后，大量(至少约为10，000)全新蛋白质或与已知蛋白质的杂化物在含有能够表达这些蛋白质的基因的宿主细胞(细菌或真核的)的存在下产生，并且为了确定它们中的哪一种产生具有新要求特性的蛋白质，随后在上述无性繁殖系中进行筛选，其性质有如结构的，酶的、催化的、抗原的、药理的或配体的特性，以及更一般的化学、生化、生物学等特性。其次本专利技术的目的在于通过修饰上述随机因或其产物而改进所要求的功能。同样，本专利技术的目的表明了获得且随之改进具有可利用的显著的化学、生化或生物学特性的DNA或RNA序列的方法。因此，本专利技术显然可供科学、工业和医学上的许多方面的大量应用。根据本专利技术，肽或多肽的制备方法的特征是它在同一培养基中同时产生了至少部分是由合成随机多聚核苷酸的构成的基因，它将这样获得的基因导入宿主细胞，同时培养了含有如此基因的转化宿主细胞的独立无性系，因而无性繁殖了随机基因并获得了通过这些随机基因的每一个所表达的蛋白质产物，它以鉴别那些产生了具有至少一种所要求特性的肽或多肽的无性系的方式选择和/或筛选转化的宿主细胞无性系，随之将这样鉴定出的无性系分离出来并培养之，使它们产生至少一种具有所述特性的肽或多肽。当所要求特性需要改进时，该方法包括对产生已确定肽的基因的修饰，继之以上述基因的再次无性繁殖，并选择或筛选转化细胞以确定那些产生至少一种具有改进功能的肽或多肽的细胞。它也包括蛋白质生产物本身的修饰。利用本技术的首要的方法为，通过四种脱氧磷酸核苷酸A、C、G和T从一个起始线性表达载体的两端的随机共聚产生随机基因，随后以这样的方式合成粘性末端以便形成由一分子具有两个3′末端是互补的随机序列的表达载体所构成的随机起始单链DNA，随之合成随机DNA的副链。利用本技术的另一方式为，通过没有粘性末端的寡核苷酸的共聚产生随机基因，采用合成随机DNA碎片的方式，然后将这些碎片连到预先线性化的表达载体上。表达载体可以是一个质粒，显著的是细菌质粒。应用pUC8质粒作为表达载体已经获得了极好的结果。表达载体也可以是病毒DNA或者质粒与病毒DNA的杂化物。宿主细胞可以是原核细胞，如HB101和C600，或者是真核细胞。当应用上述第二种方式的技术时，能够利用形成了一组回文八聚体的寡核苷酸。利用下述回文八聚体取得了极好的结果5′GGAATTCC 3′5′GGTCGACC 3′5′CAAGCTTG 3′5′CCATATGG 3′5′CATCGATG 3′还能够应用形成一组回文七聚体的寡核苷酸。应用下列回文七聚体取得了好结果5′XTCGCGA 3′5′XCTGCAG 3′5′RGGTACC 3′此处X＝A、G、C或T、R＝A或T按照利用这些特别有利的技术的方法，可以从一转化宿主细胞的独立无性系培养物中分离并提纯质粒的转化DNA，转化宿主细胞按上述方法获得，经后用至少一种对应于在回文八聚体或七聚体上所表现出来的而在所用表达载体上所没有的特异限制切割位点的限制性内切酶切割这些质粒;切割后将限制性内切酶钝化，然后同时用T4DNA连接酶处理这样获得的线性随机DNA碎片的群体，以这样的方式得到了含有随机序列的新的一套DNA，由此这个新群体含有比在起始群体中的基因数量更大的随机基因量。然后用这批新的转化DNA转化宿主细胞并无性繁殖这些基因，最后选择和(或)筛选并分离转化宿主细胞的新无性系并培养之以生产至少一种肽或多肽，例如，一种新型的具有所要求特性的蛋白质。任何其它的用以产生并无性繁殖随机DNA序列以使其表达为新肽、多肽或蛋白质，或表达为融合蛋白质的新部分，继之以筛选或寻找所要求特性并获得至少一种产生具有所要求特性的肽的无性系的方法，都能够根据本专利技术而应用。作为选择宿主细胞无性系标准的特性可为由给定无性系所产生的肽或多肽催化给定化学反应的能力。进而，对于几种肽和(或)多肽的生产来说，上述性质可为催化一系列反应的能力，这些反应将一组起始化合物变成至少一种目标化合物。为了生产由几种或许多种反身自催化的肽和(或)多肽所构成的群体，上述特性可为在适宜环境中由氨基酸和(或)寡肽催化合成该群体的能力。上述特性也可以是选择性地修饰给定化合物的生物学或化学性质的能力，例如，选择性修饰一个多肽的催化活性的能力。上述特性还可以是模拟、抑制、或修饰至少一种生物活性化合物的至少一种生物功能的能力，例如激素、神经递质、附着因子、生长因子以及DNA复制和(或)转录和(或)RNA的转译的特异调节因子。上述特性亦可为肽或多肽结合于一给定配体上的能力。本专利技术的目的还在于，将通过上述技术得到的肽或多肽用于配体的检测和(或)滴定的用法。按照应用的特别有利的方式，选择转化宿主细胞无性系的标准是这些肽或多肽模拟或改变一生物活性分子例如一种蛋白质的作用的能力;产生至少一种具有如此特性的肽或多肽的转化宿主细胞无性系的筛选和(或)选择通过制备或获得对抗活性分子的抗体进行，随之在将它们提纯之后利用这些抗体鉴别含有那些结合有上述对抗活性分子的抗体的肽或多肽的无性系，然后通过培养已经鉴别了的无性系分离并提纯由这些无性系所产生的肽或多肽，最后对肽或多肽进行体外检测，证实它具有模拟或修饰上述分子的作用的能力。随机肽模拟或修饰上述分子作用的能力，能够通过修饰给该肽编码的基因，用修饰了的基因重新转化宿主细胞并对那些改进了所要求功能的修饰进行选择或筛选而得到改善。此外，上述肽可被化学修饰，或诱导从而改善其功能。根据这种方法应用本专利技术的此项技术，作为选择标准的特性是具有至少一种与给定抗原的抗原决定部位之一相似的抗原决定基的性质。本专利技术继续下去可由前述方法得到多肽并用作化疗活性物质。尤其在上述抗原是EGF的情况下，本专利技术可获得用于上皮癌化疗的多肽。本专利技术还适用于应用前述技术制备疫苗，其特征为分离抗致病作用的抗体，例如在给一能够产生抗此作用物的抗体的动物体内注射进致病作用物之后产生了抗体，这些抗体可用于鉴别产生至少一种最低限度具有类似于致病作用物抗原决定部位之一的抗原决定基蛋白质的无性系，对应于这些无性系的转化宿主细胞进行培养以产生这些蛋白质，从细胞无性系中分离纯化该蛋白质，然后用此蛋白质制备抗致病作用物的疫苗。如上所述，纯化了的蛋白质可经编码该蛋白质的随机基因修饰(例如，致突变)而改进，将这些基因再次转化进适当的表达修饰蛋白质的宿主细胞中，再次筛选或选择那些将结合于抗起始抗原作用物的抗体的并具有改进功能蛋白质，并利用这些改良蛋白质生产疫苗。例如，为制备抗HVB疫苗，可提取并纯化HVB病毒的至少一种衣壳蛋白，将该蛋白注射进一种能够产生抗这种蛋白质的抗体的动物体内，回收并纯化这样形成的抗体，利用这些抗体去鉴别产生至少一种蛋白质的无性系，该蛋白质具有至少一个类似于HVB病毒的抗原决定部位之一的抗原决定基，随后培养在某种程度上与这些无性系相称的转化宿主细胞无性系以产生该种蛋白质，从这些细胞的无性系培养基中分离并纯化该蛋白质并用它制备抗HVB疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过微生物法产生肽或多肽的方法，其特征在于至少有一部分是由随机的合成多聚核苷酸组成的基因可在一种普通培养基中同时产生，如此获得的基因被导入宿主细胞中，含有这些基因的转化宿主细胞的独立无性繁殖系同时被培养以便无性繁殖那些随机基因并导致由这些随机基因各自所表达的蛋白质的产生，对这样的转化宿主细胞的无性繁殖系以鉴定那些产生至少具有一种专一性的肽或多肽的无性繁殖系的方式进行选择或筛选，分离那些如此鉴定出的无性繁殖系，然后以产生至少一种具有上述特性的肽或多肽的方式培养之。

【技术特征摘要】
CH 1985-3-30 1379/85-81.通过微生物法产生肽或多肽的方法，其特征在于至少有一部分是由随机的合成多聚核苷酸组成的基因可在一种普通培养基中同时产生，如此获得的基因被导入宿主细胞中，含有这些基因的转化宿主细胞的独立无性繁殖系同时被培养以便无性繁殖那些随机基因并导致由这些随机基因各自所表达的蛋白质的产生，对这样的转化宿主细胞的无性繁殖系以鉴定那些产生至少具有一种专一性的肽或多肽的无性繁殖系的方式进行选择或筛选，分离那些如此鉴定出的无性繁殖系，然后以产生至少一种具有上述特性的肽或多肽的方式培养之。2.按照权项1的方法，其特征在于这些基因是由四种类型的脱氧磷酸核苷酸A，C，G，和T的随机共聚作用而产生的，随机共聚作用是从一个预先线性化的表达载体的两个末端开始的，然后通过这样的方式形成粘性末端，即产生包含具有两个随机序列的一个表达载体分子的随机DNA的第一股，所述两个随机序列的3′末端是互补的，随后合成随机DNA的第二股。3.按照权项1的方法，其特征在于基因是由那些没有粘性末端的双股寡核苷酸的随机共聚作用产生的，其方式为形成随机DNA的碎片，然后在一个预先线性化的表达载体中连接这些碎片。4.按照权项2或3的方法，基特征在于表达载体是一个质粘。5.按照权项4的方法，其特征在于表达载体是pUC8。6.按照权项2或3的方法，其特征在于表达载体是病毒DNA的碎片。7.按照权项2或3的方法，其特征在于表达载体是质粘和病毒DNA的一种杂化物。8.按照权项1到7的方法，其特征在于宿主细胞是原核细胞。9.按照权项1到7的方法，其特征在于宿主细胞是真核细胞。10.按照权项8的方法，其特征在于，细胞选自HB101和C600中。11.按照权项3的方法，其特征在于寡核苷酸形成一组四文八聚体。12.按照权项11的方法，其殊征在于，四文八聚体是下列一组5′GGAATTCC 3′5′GGTCGACC 3′5′CAAGCTTG 3′5′CCATATGG 3′5′CATCGATG 3′。13.按照权项3的方法，其特征在于寡核苷酸形成一组四文七聚体。14.按照权项13的方法，其特征在于，四文七聚体是下列一组5′XTCGCGA 3′5′XCTGCAG 3′5′RGGTACC 3′其中X＝A，G，C，或T，R＝A或T。15.按照权项4和权项12或14之一的方法，其特征在于，首先分离和纯化由培养转化宿主细胞的独立无性繁殖系得到的转化DNA，转化的宿主细胞是以在权项11或权项13中限定的方式获得的，然后至少用一个对应着存在于这些四文八聚体和七聚体中的特异限制位占的限制性内切酶切割纯化的DNA，但所用的表达载体上没有该特异限制性位点，此后用DNA连接酶同时处理如此得到的线性化随机DNA碎片的整体，以这样的方法产生一种含有新的随机序列的新的DNA整体，利用这种新的转化DNA整体转化宿主细胞并无性繁殖这样的基因，最后对新的转化细胞无性繁殖系进行选择或筛选和分离，并培育这些无性繁殖系以便产生至少一种具有所需特性的肽或多肽。16.按照权项1的方法，其特征在于所述的特性为催化一种给定化学反应的能力。17.按照权项1产生几种肽和/或多肽的方法，其特征在于，所述的特性为催化由给定的起始化合物直至形成至少一个目标化合物的一系列反应的能力。18.按照权项16产生由一个以上反身自催化的肽和/或多肽组成的整体的方法，其特征在于所述的特性为催化由氨基酸和/或寡肽开始的整体本身的合成的能力。19.按照权项1的方法，其特征在于，所述的特性为选样修饰一种给定化合物的化学性质或/和生物学性质的能力。20.按照权项19的方法，其特征在于，所述的特性为选择修饰一种多肽的催化活性的能力。21.按照权项19的方法，其特征在于，所述的特性为模拟或修饰至少一种生物活性化合物的至少一个生物学功能的能力。22.按照权项21的方法，其特征在于，所述的生物活性化合物选自激素，神经递质，粘连或生长因素，以及DNA的复制和/或转录，和/或RNA的转解的特异调节剂中。23.按照权项1的方法，其特征在于，所述的特性为与一种给定配位体结合的能力。24.用按照权项23所获得的肽或多肽检测和/或滴定配位体。25.按照权项1的方法，其特征在于，所述的特性为至少有一个与给定抗原的抗原决定部位相似的抗原决定部位。26.按照权项19和25的方法，其特征在于所述的性质为模拟或修饰一种生物活性分子的作用的能力，对产生具有该特性的至少一种的肽或多肽的转化宿主细胞无性系的筛选和(或)选择，是这样完成的，即制备或获取抗(给定)分子的抗体，并且利用如此获得的这些抗体鉴定那些含有通过抗体而结合的那些肽或多肽的无性繁殖系，然后通过培育这样鉴定的无性繁殖系并分离和纯化由这些无性繁殖系所产生的肽或多肽，最后通过提供这些肽或多肽在体外测定证实它(它们)实际上有模拟或修饰所述分子的作用的能力，模拟或修饰所述分子作用的能力方面的改进可通过对所鉴定的肽或多肽编码的随机基因(不论突变或不突变)的修饰，然后重...

【专利技术属性】
技术研发人员：马克巴利维特，斯图亚特阿兰考夫曼，
申请(专利权)人：马克巴利维特，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]