生产疏水多肽、蛋白质或肽的方法技术

本发明专利技术提供了适用于生产和纯化疏化多肽、蛋白质或肽的方法。本发明专利技术进一步提供了用于生产和纯化疏水多肽、蛋白质或肽的融合蛋白质。此外，本发明专利技术还提供了均一的单体ｂ－淀粉状蛋白肽和使用所说的单体ｂ－淀粉状蛋白肽筛选淀粉状蛋白毒性抑制药物的试验。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】以基因技术制备杂合基因的可能性为组构重组体蛋白质打开了新的途径。将编码所需蛋白质的基因序列与对配基有高亲和性之蛋白质片段的基因编码序列相连接，有可能使用亲和肽以一个步骤纯化融合蛋白质形式的所需重组体蛋白质。借助位点特异性诱变，也有可能在亲和肽和所需重组体蛋白质的连接点上引入特异性化学或酶切位点，这样在借助适当的亲和树脂纯化融合蛋白质后即可经化学或酶促裂解来回收所需的重组体蛋白质。然而，当所需的重组体蛋白质在其氨基酸序列中也含有这样的化学或酶促裂解位点时，则对所需重组体蛋白质的回收就将是极其困难的。在这种情况下，所需的重组体蛋白质很容易被迅速降解。为了抑制这种降解，本专利技术提供了融合蛋白质和可以在不影响所需重组体蛋白质的情况下在特定的化学或酶促裂解位点上进行选择性裂解的方法。本专利技术的方法可特异地应用于生产疏水多肽、蛋白质或肽。更具体地说，本专利技术涉及有下列通式的融合蛋白质A-B-C其中A是大体积亲水肽，B是选择性裂解位点，C是所需的疏水多肽、蛋白质或肽。与根据本专利技术的融合蛋白质结合使用的术语“大体积亲水肽”涉及以其大小和产生良好结构区域之亲水氨基酸含量为特征的亲水肽。根据本专利技术的融合蛋白质的大体积亲水肽A具有双重功能a)有利于融合蛋白质的高表达和b)使裂解位点C暴露于疏水基质柱上的流动相。根据本专利技术的融合蛋白质的优选大体积亲水肽是具有下式肽序列的亲水肽(NANP)x其中X是10-40，且最好是19。选择性裂解位点可以是化学或酶促裂解位点。适当的选择性酶促裂解位点可以是氨基酸序列-(Asp)n-Lys-，其中n代表2，3或4，或可分别被蛋白酶肠激酶和凝血因子Xa特异性识别的-Ile-Glu-Gly-Arg-，被胰蛋白酶裂解的精氨酸残基或赖氨酸残基、被赖氨酰肽链内切酶裂解的赖氨酸残基或被V8蛋白酶裂解的谷氨酰胺残基。作为适当的选择性化学裂解位点，可考虑有被3-溴-3-甲基-2-(2-硝基苯基巯基)-3H-吲哚裂解的色氨酸残基、被2-亚硝基-5-硫氰基苯甲酸裂解的半胱氨酸、可分别被酸和羟胺裂解的氨基酸二肽Asp-Pro或Asn-Gly，以及较好可被溴化氰(CNBr)特异地裂解的蛋氨酸残基。与根据本专利技术的融合蛋白质结合使用的术语“疏水多肽、蛋白质或肽”是指以浓度为30-60%，较好约40%的加在含水缓冲液中的有机溶剂，如加在含水缓冲液中的浓度高于40%的乙醇，从反相HPLC柱上洗脱的疏水多肽、蛋白质或肽。作为疏水多肽、蛋白质或肽，例如考虑有表面抗原、淋巴激活素受体、HIV-1和HIV-2被膜和结构蛋白质、丙型肝炎被膜和结构蛋白质或有膜锚地序列的任何蛋白质。优选的疏水多肽、蛋白质或肽是具有下示序列的b-淀粉状蛋白肽(bA4-淀粉状蛋白)1 42DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(Seq ID No1)在35位上有亮氨酸(Seq ID No3)、丝氨酸(Seq ID No4)、谷氨酰胺(Seq ID No5)或谷氨酸(Seq ID No6)残基代替蛋氨酸或蛋氨酸亚砜残基的bA4-肽点突变，以及有下示序列的HIV-1被膜肽1 35RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS(Seq ID No11)可将根据本专利技术的融合蛋白质的大体积亲水肽和选择性裂解位点连接到疏水多肽、蛋白质或肽的氨基末端氨基酸或羧基末端氨基酸上。本专利技术的融合蛋白质可以含有优选结合于亲和载体材料上的特异性序列。这样的序列例如可以是含有至少两个相邻组氨酸残基的序列(可参见欧洲专利申请No.282 042)。这些序列可特异地结合到次氮基三乙酸镍络合树脂上(Hochuli and D beli，Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368，748(1987);欧洲专利No. 253 303)。因此可以从保留的多肽中选择性地分离出含有这种特异序列的本专利技术的融合蛋白质。可以将此特异性序列连接到大体积亲水肽的氨基酸序列上或者亲水多肽、蛋白质或肽的氨基酸序列上。本专利技术还涉及编码这些融合蛋白质的基因、含有这些基因的表达载体、用这些表达载体转化的微生物以及制备所说的基因、表达载体和被转化微生物的方法。按照文献中描述的重组DNA技术的方法制备本专利技术的融合蛋白质。较好首先合成编码所需疏水多肽、蛋白质或肽的核苷酸序列，然后再将此序列与编码大体积亲水肽和选择性裂解位点的核苷酸序列连接。也可按照已知的方法将如此得到的杂合基因掺入到表达载体中。例如可参考Maniatis等人("Molecular Cloning"，Cold Spring Harbor Laboratory，1982)的教科书和Sambrook等人("Molecular Cloning-A Laboratory Manual"，2nd. ed.， Cold Spring Harbor Laboratory，1989)的教科书。表达本专利技术融合蛋白质的方法也是已知的，并在上述教科书中有详细的描述。它们包括下述步骤a)用其中上述杂合基因已可操纵地结合到表达控制序列上的表达载体转化适当的宿主生物体，特别是大肠杆菌;b)在适当的生长条件下培养如此得到的宿主生物体;c)从宿主生物体中提取并分离所需的融合蛋白质。作为宿主生物体，可以是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，例如大肠杆菌和枯草芽胞杆菌菌株。大肠杆菌菌株M15是本专利技术的特别优选的宿主生物体。但也可以使用与上述大肠杆菌菌株不同的、一般可以得到的大肠杆菌菌株，例如大肠杆菌294(ATCC No. 3144)、大肠杆菌RR1(ATCC No. 31343)和大肠杆菌W3110(ATCC No. 27325)。本专利技术融合蛋白质允许在不影响所需疏水多肽、蛋白质或肽的情况下在特定化学或酶促裂解位点上进行选择性裂解。所需的疏水多肽、蛋白质或肽扩散到疏水基质柱的固相中，便能够定位本专利技术的融合蛋白质，以便隐藏所需的疏水多肽、蛋白质或肽。另一方面，大体积亲水肽将选择性裂解位点暴露于含水流动相。这样就允许经选择性裂解除去大体积亲水肽而只留下结合到柱上的所需的疏水多肽、蛋白质或肽。然后可经加入有机溶剂而洗脱掉所需的疏水多肽、蛋白质或肽。因此，本专利技术还提供了允许生产和纯化所需疏水多肽、蛋白质或肽的方法，该方法包括下列步骤a)使含有本专利技术融合蛋白质的水溶液通过疏水基质柱，b)用含有裂解试剂或酶的溶液冲洗该柱，以及c)用与水混溶的溶剂除去由此得到的所需疏水多肽、蛋白质或肽。作为疏水基质柱，可以是结合到硅胶基质柱上的氰基丙基、环己基、苯基、辛基或十八基基团。在本专利技术的实践中，较好使用在反相高效液相层析(HPLC)条件下的RP-18(十八基结合的硅胶微颗粒柱)。在用根据本专利技术的融合蛋白质装柱之前，用缓冲液常规平衡疏水基质柱。平衡缓冲液可含有变性剂或高离液序列剂(Chaotropic agent)如盐酸胍、尿素，或去污剂如Triton。加入这样的变性剂、高离液序列剂或去污剂，既使用根据本专利技术的极难于溶解于水溶液的融合蛋白质，也不会有操作上的问题。将本专利技术的融合蛋白质加到也可含有变性剂或去污剂例如盐酸胍、尿素或Triton的缓冲液中，然后上疏水基质柱。用含有裂解剂或酶的缓冲液洗柱以完成裂解。最适宜缓冲液组成取决于本文档来自技高网...

【技术保护点】
有下列通式的融合蛋白质：Ａ－Ｂ－Ｃ其中Ａ是大体积亲水肽，Ｂ是选择性裂解位点，Ｃ是所需的疏水多肽、蛋白质或肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：H德贝利，N德雷格，GH特罗特曼，P雅各，D施图伯，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]