溶剂诱导的细胞自溶作用制造技术

从酵母细胞中回收蛋白质（例如酶）的方法，包括：在适当的ｐＨ下，形成一个含有酵母细胞、水和较少有效量的多氯脂肪族碳氢化合物的混合物；在适当温度和时间．例如室温，１６－９０小时下孵化．所得上清液分离成含高活性酶的水溶液．如果需要．酶可以收回．典型的应用包括以脆壁克鲁维酵母获取乳糖酶，以巴斯德毕赤酵母获取醇氧化酶．典型的溶剂则包括二氯甲烷、１，１，１－三氯乙烷与氯仿．（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及从酵母细胞中提取蛋白质的一种方法。另一方面，本专利技术涉及破碎细胞来释放蛋白质(例如酶)的几种方法。更进一步，本专利技术还涉及从酵母中获取酶的方法。发酵技术与各种碳能培养基、特定的微生物菌株结合能够产生有用的胞内酶。人们迫切需要破碎细胞，获得细胞内所含的蛋白质，尤其是需要从中获取有用的酶，而酶本身没有遭到破坏。现已有各种破碎酵母细胞，以释放所含蛋白质，特别是酶的方法。机械破碎技术中包括了球磨、研磨、声波处理等，且常用冷却的办法来减少蛋白质的断裂。然而，机械破碎总是使酶发生降解，而得到极不均匀的细胞碎片混合物，这种混合物则很难同水溶性成分有效地分离开来。也可通过加酶来使细胞壁破坏或破碎，释放出细胞内含物。但是，所加的酶可能是昂贵的，同时也引进了异种蛋白质，带来一些不必要的分离问题，或者是在使用所需的酶的过程中引起一些不必要的副作用。已采用过化学方法来引起自溶作用(质壁分离)，包括了各种碳氢化合物，例如甲苯;羰基化合物，它包括乙酸乙酯、丙酮，其它二烷基酮;以及其它化学物质，例如乙醚和醇，如C-C的烷基醇。这些化学方法的结果随所用的有机物，细胞生长条件，暴露时间和溶剂浓度而变化。其中有些方法是危险的，这是因为在所要求的处理温度下，挥发性可为燃烧，实际上是爆炸创造条件。一些方法需要高浓度的溶解剂，这势必在以后的纯化步骤中引起一些分离上的麻烦。利用安全的材料，温和的条件与最小的外加溶解成分，来获得从细胞中释放出蛋白质的良好结果的新方法仍然是当前的需要。专利技术人发现，某些在水中浓度相对来说十分低的多氯脂肪族处理剂，伴随几小时的大约在室温下的孵化就能导致酵母细胞的分解(断裂)，从而释放出细胞内产物，包括酶和其它蛋白质。本专利技术人的方法是，利用水中非常少量的多氯脂肪族处理剂与酵母细胞的混合，组成一种水的分散体系，得到的三组分混合物须孵化一定的时间。此方法实质上是使所有细胞适当的破裂，一般来说至少有80%(以个数计)的细胞破裂，使可溶性蛋白质成分释放到水的分散体系中，而后，这些酶和其它蛋白质可采用常用的方法回收。本专利技术人的方法是，利用多氯脂肪族处理剂产生溶剂诱导的自溶作用，此法温和，可靠、效率高、酶回收好、劳动强度小。加入相当少的多氯脂肪族处理剂不会干扰回收过程，也不需要分离。实际上，在细胞分解后所需的纯化过程中，它们能够作为抑菌剂。多氯化合物本专利技术人所用的多氯脂肪族处理可称之为非苯型碳氢化合物的多氯衍生物。更详细地说，这些处理剂是链烃的多氯衍生物，通常在标准温度和压力下是液体。下面的例子是一些可以利用的，在常温常压下是液体的链烃多氯衍生物，它们能够单独使用或混合使用。以下这些化合物仅仅是作为例子而已，而不限于此范围。二氯甲烷1，2-二氯乙烯(顺式或反式)1，1-二氯乙烷氯仿2，2-二氯丙烷1，1，1-三氯乙烷四氯化碳氯化乙烯三氯乙烯1，2-二氯丙烷1，1，2-三氯乙烷四氯乙烯1，3-二氯丙烷s-四氯乙烷(对称四氯乙烷)1，2，3-三氯丙烷五氯乙烷目前，以氯仿或二氯甲烷最好。酵母的范围根据本方法，本专利技术使用了在水溶液的有氧的发酵条件下生长在含碳培养基上的酵母细胞。合适的酵母包括了以下这些属的种，例如假丝酵母属、汉逊酵母属、球拟酵母属、酵母属、毕赤酵母属、德巴利酵母属和酒香酵母属。目前最好的属包括假丝酵母属、汉逊酵母属、球拟酵母属、毕赤酵母属、酵母属。合适种的实例包括亲石酒香酵母 粉状毕赤酵母博伊丁假丝酵母 多形毕赤酵母解脂假丝酵母 膜醭毕赤酵母糙醭假丝酵母 松毕赤酵母产朊假丝酵母 巴斯德毕赤酵母星形假丝酵母 喜海藻糖毕赤酵母强力假丝酵母 酿酒酵母克劳森假丝酵母 脆壁酵母皱落假丝酵母 罗斯酵母热带假丝酵母 产酸酵母汉逊德巴利酵母 雅致酵母小汉逊酵母 鲁酵母土星汉逊酵母 乳酸酵母加州汉逊酵母 声生球拟酵母森林汉逊酵母 白球拟酵母多形汉逊酵母 波蒙球拟酵母碎囊汉逊酵母 易变球拟酵母葡糖酶汉逊酵母 光滑球拟酵母亨利汉逊酵母 胎生球拟酵母不发酵汉逊酵母 草树球拟酵母威克汉汉逊酵母 喜硝酸盐球拟酵母喜林竽汉逊酵母 松球拟酵母霍氏梯汉逊酵母 泡滤球拟酵母如果需要，可用两个或更多的酵母种的混合物。众所周知，不同的酵母需要略有不同的培养基使它们很好地生长，专一的生物化学转化需用专一的酵母属或种来顺利地进行，因此，采用哪一种或哪一些酵母，部分地取决于所用的含碳养基。例如，已知以上某些种的特定菌株不能在甲醇上很好地生长，即不能利用甲醇。处理方法酵母细胞很容易处理成一种细胞浆，它包含着全部酵母细胞的物质成份，若以整个细胞为基础，固体的重量百分含量大约为8.5-15%，最好为10-13%。酵母细胞能与水和本专利技术人的多氯处理组分混合，形成一种水浆，每升约含85-150克细胞，最好时含100-130克。较低的细胞浓度也可采用，但结果可能不会那么令人满意。目前的数据指出，细胞重量浓度低到2-3%时，酶释放就不会发生。水浆或细胞浆其余的百分组成实质上是水和多氯处理剂。水组分可以是纯水、含少量盐的水，或者是发酵器流出物中的不经处理的液体，用这种液体可能是方便的，切实可行的，或者是所希望的。以整个三组分体系为基础，在处理剂、时间和温度一定的情况下，多氯处理剂的量应该能有效地使特定细胞自溶。建议处理剂的体积百分含量约为0.8-6%，最好约是1.5-4%。混合可通过任何方便的方法进行，例如倒在一起，搅拌等，这取决于所用的量和材料。不要机械拍打或强烈混合，以免引起细胞的物理破裂。任何混合顺序都是合适的。细胞与水组分混合，然后加多氯处理化合物，这个顺序目前是最好的。但是，也能够先将多氯化合物和水组分混合，再加入酵母细胞。最好的方便的办法是利用从发酵步骤出来的水合酵素本身，它含有上清液的水溶液和悬浮的酵母细胞。如有需要，这些细胞能通过诸如离心、过滤的办法得到分离。如果要排除残余的矿物，则可用水洗，然后再悬浮在淡水中。换句话说，如有需要，水合酵素的细胞浓度可通过过滤、离心、除溶剂或诸如此类的办法得到增加。若水合酵素来自高细胞密度酵母发酵过程，则在需要时，可直接使用这种水合酵素。PH对于三组分体系，虽然PH在约6.5-8.5这样一个范围是合适的，但起初最好调到PH至少约为7，比较好是大约7.25-8的PH起始调节范围。某些酵母的水分散体系的PH随时间变化常略有点降低。生产酵母细胞的水合酵素的PH通常有点偏酸性。在某些情况下，加入少量的稀的氢氧化铵、氢氧化钠，或者相似的碱，最好是稀溶液，可调节PH。温度接触温度可以方便地采用大体上是室温范围这样的温度，或者当水合酵素本身被直接使用时，通常从发酵罐出来时水合酵素的温度。通常采用的接触温度约为20至35℃，更好的是约25至35°为方便起见，最好把接触温度取定为保存或孵化时的温度。保存时间(Holding Time)“保存”或“孵化”时间应至少约16小时，较常用的是约16至90小时，目前最好的时间约是24至48小时。由酵母细胞、水和多氯处理化合物混合而成的三组分体系可在不锈钢、玻璃衬里或类似的保存器、罐中保存一定的时间。发酵容器本身也可用作保存器。PH和温度应按上述条件控制本文档来自技高网...

【技术保护点】
从整体酵母细胞中回收蛋白质的一种方法包括，它包括：（ａ）形成一种已调过ＰＨ的水的混合物，它由含蛋白质的酵母细胞和大量的水溶液，以及较少的有较量的通常为液态的多氯脂肪族碳氢化合物处理剂所组成，其中所说的ＰＨ大约为６．５－８．５，而其中所说 的混合物含有０．８－６％（以体积计）的处理剂，（ｂ）在温度约２０－３５℃，ＰＨ约６．５－８．５的条件下孵化所说的混合物１６－９０小时，由此，至少有一部分所说的蛋白质从所述细胞中释放到所述的水里，形成一种含蛋白质的水溶液，（ｃ）分离液 体和固体材料，其中所述的液体中含蛋白质。

【技术特征摘要】
US 1985-6-10 742,836书。发酵描述下面所做的发酵描述代表几种类型的发酵过程，它们为进一步的处理提供含细胞的流出液，如以下实例所述。在一个连续的有氧发酵过程中，甲醇和无机盐水介质以40∶60的体积比分别投入到发酵罐中，用酵母种巴斯德毕赤酵母NRRL Y-11430接种，投入的速率恰使甲醇成为生长限制因素。发酵罐是一个1500升充满泡沫的发酵器，其中盛有液体610升，发酵罐可自动控制PH、温度和液面。用常用的浆型叶轮搅拌，转速1000转/分。通气速率为发酵罐中一体积的酵素每分钟通4体积空气(表压，约38镑/平方英寸;25℃)。无水氨按维持发酵混合物PH在3.5左右的速率加入。无机盐水介质的制备方法是将15.86毫升75%(以重量计)H3PO4、9.53克K2SO4、7.8克Mg SO4·7H2O、0.6克CaCl2·2H2O和2.6克85%(以重量计)KOH与一升自来水混合而成。无机盐水介质以31.5升/小时的速率投入，甲醇以21升/小时的速率投入。微量无机盐溶液(就一升溶液来说)是将65克FeSO4·7H2O，20克ZnSO4·7H2O，3.0克MnSO4·H2O，6.0克CuSO4·5H2O，5.0毫升浓H2SO4和足够的去离子水混合而制成1升溶液。加有酵母生长素的微量无机盐溶液是将780毫升微量无机盐溶液，20毫升水，200毫升甲醇和0.032克酵母生长素混合而制成的。加有酵母生长素的无机盐溶液的投入是借助于甲醇流，按每升甲醇10毫升这种溶液的比率单独投入。发酵在约30℃、38磅/平方英寸压力的条件下进行，平均滞留时间约为11.6小时，细胞密度一般是每升发酵器流出物含128.4克细胞。酵素总的固体量一般约为每升134.7克。所获得的酵母细胞可通过离心的方法从发酵流出物(水酵素)中分离出来，悬浮在水中洗涤，再离心分离，在100℃干燥过夜，称重。以干重计算，酵母细胞的产生率一般大约是每投入100克甲醇得40.6克细胞。实例1加足够稀的氢氧化钠，将巴斯德毕赤酵母NRRL Y-11430水浆或细胞浆的PH调到7.5，每升水浆或细胞浆大约含130克纯细胞，这种水浆或细胞浆基本上是按发酵描述部分所述的方法，从以甲醇作培养基的高细胞密度发酵过程中获得的。加0.5毫升所选用的处理剂到15毫升已调过PH的细胞浆内。所得处理混合物在室温下保存约两天，有时掺合一下。然后，对每个样品进行离心，测定上清液的醇氧化酶活性，获得如下结果表Ⅰ实验标号使用的溶剂醇氧化酶活性(a)1 水 无2 0.5克醋酸钠 很小3 四氢呋喃 很小4 己烷 很小5 氯仿 63.96 甲苯 6.47 乙醚 0.338 乙醚(0.1毫升) 很小9 0.6%叠氮化钠 很小10 二甲基亚砜 很小11 丙酮 很小12 1% Triton X-100(b)很小13 乙酸乙酯 很小(a)酶活力单位/毫升，按邻联(二)茴香胺/过氧化物酶法测定。(b)R-ohm-Haas表面活性剂。己烷和乙醚是已知的处理剂，它们用来作比较。显然，本发明中的第5号实验在所用的浓度范围内比其它一些的活性高几个数量级。实例Ⅱ加1.5毫升所选用的处理剂到50毫升已调过PH的巴斯德毕赤酵母细胞浆样品中，混合，室温下放置，样品的制备方法基本与上述方法相似。24小时以后，再加1.5毫升处理剂到己烷样品中。下面的第17号实验中加了3毫升乙醚，总孵化时间约48小时。其它样品的总孵化时间也为28小时，样品离心分离，按上述方法测定。表Ⅱ标号处理剂处理剂总量(毫升) 所得上清液醇氧化酶活性(a)14 己烷 3.0 0.4715 氯仿 1.5 189.716 乙醚 1.5 017 乙醚 3.0 219.618 甲苯 1.5 48.5(a)见表Ⅰ脚注(a)在高浓度时，加乙醚所得的上清液表现出相当大的醇氧化酶活性。这一既有的工艺方法因使用易燃、可能爆炸的材料而受到影响。本发明用氯仿的方法显示出非常高的活性，这与用乙醚的方法相似，而且本发明用的是一种在低浓度下相对安全的试剂。同时还应注意的是这些处理过的细胞能够离心沉淀，所需g力比机械破碎(珠研磨机或法兰四压榨器)细胞所需的力要小，而且产生非常好的上清液。己烷法和甲苯法实际上是无效的。实例Ⅲ巴斯德毕赤酵母NRRL Y-11430的生产仍基本上按上述方法进行。巴斯德毕赤酵母水浆每升约含130克细胞，0.01%(以重量计)的叠氮化钠，并按上述方法调PH至7.5，分别加入不同量的氯仿或二氯甲烷。将所得混合物室温放置约四天(96小时)，有时振荡一下。然后，每个样品以13，000转/分的转速离心分离15分钟。上清液在4℃储存，约两天后，分析醇氧化酶。表Ⅲ50毫升毕赤酵母浆 醇氧化酶 溶液的颜色标号处理剂所加处理剂毫升数的测定(a)19 氯仿 0.5 366.8 深红20 氯仿 1.0 318.5 红21 氯仿 1.5 235.7 红22 二氯甲烷 0.5 311.6 深红23 二氯甲烷 1.0 149.5 红24 二氯甲烷 1.5 209.3 红(a)见表Ⅰ脚注(a)以上结果表明，无论是氯仿还是二氯甲烷都产生所需的含醇氧化酸上清液。看来在所用的相当长的孵化时间内，较小量的多氯化合物生产能力大。实例Ⅳ下面的实验仍然用上述的巴斯德毕赤酵母，实验过程也基本上与上面的相同。但是孵化时间是48小时，而不是上述实例的96小时。所得上清液在测定前在4℃保存两天。每个例子中的巴斯德毕赤酵母的体积仍是50毫升，每升约含130克细胞，结果如表Ⅳ所示表ⅣA50毫升毕赤酵母浆 醇氧化酶 溶液的颜色标号处理剂所加处理剂毫升数的测定(a)25 氯仿 0.5 147 亮橙色26 二氯甲烷 0.5 149 亮橙色27 二氯甲烷 0.2 很小 亮橙色28 1.1.1-三氯乙烷 0.5 159 亮橙色(a)见表Ⅰ脚注(a)每种多氯处理剂都是有效的。处理剂的最小用量很容易确定，如二氯甲烷的实验所示。重复以上实验，但孵化时间是三天而不是上述的两天，所得结果如表ⅣB所示表ⅣB50毫升毕赤酵母浆醇氧化酶测定(a)标号 处理剂 中处理剂的毫升数29 二氯甲烷 1.0 18630 二氯甲烷 0.5 7231 1，1，1-三氯乙烷 0.5 29832 乙醚 1.5 28933 无 - 2(a)见表Ⅰ脚注(a)这些比较结果说明，三氯乙烷和二氯甲烷是非常有效的。将这些结果与表ⅣA的结果比较，说明在二氯甲烷量较小(0.5毫升)时，较长的孵化时间可能并不好。实例Ⅴ用以下实验分析PH对溶剂诱导的酵母细胞自溶作用的影响。所选的酵母细胞仍是上述生长在以甲醇作碳能的培养基上的巴斯德毕赤酵母NRRL-Y-11430。对一组体积为50毫升的巴斯德毕赤酵母细胞，用氢氧化铵调PH，使其在6.5-8.0的范围内。每个样品每升约含130克细胞。在每个样品中加1.0毫升二氯甲烷。每个样品孵化两天。接着将每个样品离心分离，决定其上清液的醇氧化酶活性。所得结果如下表Ⅴ标号起始PH 孵化后的PH 醇氧化酶的测定(a)34 6.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：索马斯R霍普金斯，
申请(专利权)人：菲利普石油公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]