对人癌细胞新粘蛋白样糖蛋白抗原的特异性单克隆抗体制造技术

一种能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系。该抗体可同人乳癌细胞和其它腺癌细胞表面和／或细胞质内以及正常人乳上皮细胞表面的特有的抗原决定簇结合。用选择一组免疫原和常规骨髓瘤细胞系同收集的小鼠脾细胞融合的免疫小鼠制备本发明专利技术的细胞系。该单抗被证实为ＢｒＥ２单抗。其抗原特征在于具有超过４００，０００道尔顿分子量的高分子量粘蛋白样糖蛋白复合物。本单抗特别适用于人乳癌的诊断，预后和治疗。（*该技术在2009年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种同人类癌抗原结合的单克隆抗体，特别是涉及一种同存在于人类乳腺癌和其它腺癌癌细胞表面和/或细胞质内，以及正常人乳腺上皮细胞表面上的特大分子量的粘蛋白样糖蛋白复合物特异性结合的单克隆抗体。已经制备出能识别存在于正常人乳腺上皮细胞表面上的大分子量的粘蛋白样糖蛋白复合物的单克隆抗体。可详见如下报道Petersonetal.，ImperialCancerResearchFund，London，England，March2-3(1981);Taylor-Papadimitrionetal.，Int.J.Cancer，2817-21(1981);Cerianietal.，SomaticCellGenetics，9415-427(1983)。另外一些研究人员既用人乳脂肪球作为免疫剂制备单克隆抗体;见如下报道;Taylor-Papadimitrionetal.，Int.J.Cancer，2817-21(1981);Cerianietal.，SomticCellGenetics，9415-427(1983)，和以不同的乳腺肿瘤细胞作为免疫剂制备单克隆抗体。详见Papsideroetal.，CancerResearch，431741-1747(1983);Kufeetal.，Hybridoma，3223-232(1984);Frankeletal.，J.Biol.ResponseMod，4273-286(1985);Colcheretal.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，783199-3203(1981);Fosteretal.，VirchowsArch，394279-293(1982);Ellisetal.，Histopathology，8501-516(1984);Ashalletal.，lancet，21-11(1982)上述单克隆抗体也用于识别一种粘蛋白样糖蛋白。按照Shimizu等人的报告(Shimizuetal.，BiochemJ.，233727-730(1985)发现这些单克隆抗体能识别约250，000道尔顿至超过一百万道尔顿大小的粘蛋白样糖蛋白，这取决于免疫原的制备。在人乳脂肪球膜的大分子量的粘蛋白样糖蛋白生化研究中，Shimizu等人(Shimizu，etal.，Biochem.J.233725-730(1986))建议这些糖蛋白是含有至少三个不同成分的复合物，而这三个成分至少分别代表三个不同的分子实体。因此，人乳脂肪球膜的粘蛋白样糖蛋白显示为大分子复合物，由于它们的大小，该复合物被认为具有无数的抗原决定簇。人们已制备出能同正常乳腺上皮细胞和恶性乳腺癌细胞的粘蛋白样糖蛋白结合的单克隆抗体，如Ceriani等人描述的Mc5单克隆抗体(Cerianietal.，SomaticCellGenetics，9415-427(1983))。另外，一种对豚鼠乳脂肪球膜特异性的单克隆抗体D-274被用于判断人乳腺浸润导管型癌和良性纤维囊性病中的大于400，000道尔顿的粘蛋白样糖蛋白的分布。参见(Greenwaltetal.，AmJ.Pathol.，118351-359(1985))。现有技术中已制备的单克隆抗体将同正常人乳腺上皮细胞，乳腺癌细胞以及其它组织的某些上皮细胞结合。提供一种在正常乳腺上皮细胞表面和其它组织的某些癌细胞及人乳腺细胞表面和/或细胞质内表达的独特的抗原决定基相结合的单克隆抗体将会大大地有益于肿癌细胞的鉴定、诊断、预后和治疗。一种同人乳腺癌细胞和其它腺癌癌细胞的表面和/或细胞质内的，以及同正常人乳腺上皮细胞表面的新颖的粘蛋白样糖蛋白抗原相结合的单克隆抗体，该单克隆抗体不与心脏、肝脏、卵巢、脾脏、睾丸、脑、前列腺、甲状腺、膀胱、结肠、食管和子宫正常组相结合。被这种单克隆抗体识别的抗原被称作BrE2，其特征在于具有大于400，000道尔顿的大分子量。BrE2单克隆抗体的特异性有利于在评估和治疗乳腺癌时进行鉴别诊断、预后、诊断以及可能的治疗中加以应用。用正常去脂人乳脂肪球做成免疫制剂，制备BrE2单克隆抗体。用Kohler和Milstein描述的标准工作程序(Kohler&Milstein，Nature，256495-493(1975))制备本专利技术的单克隆抗体。使用Ceriani等人描述的制备方法制备的完全去脂人乳脂肪球(HMFG)免疫宿主动物。(Cerianietal.，Prcc.Natl.AcadSciUSA.74582-586(1977))。宿主动物是新西兰小黑鼠(NZBmice)，在适当时间的保温之后，采集小鼠脾细胞。然后，使用熟知的聚乙烯二醇技术将采集到的小鼠脾细胞同P3-X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞进行融合。用Ceriani等人(Cerianietal.，SomatciCellGenetics，9415-427(1983))描述的在微量滴定盘的孔内采用固相放免结合测定法和用HMFG以及HMFG成分的ELISA测定法完成筛选鉴定产生本专利技术单克隆抗体的杂交瘤或杂交细胞系。然后，筛选出对宫颈癌和结肠癌细胞系上HMFG阳性的各孔。找到一种未被这些癌细胞系染色的单克隆抗体，并且分离出产生那种抗体的杂交细胞。这样单克隆抗体被认为是抗-BrE2(Anti-BrE2)。用Towbin等人报告的WesternBlottest(法)(Towbinetal.，Proc.Natl.Acad，Sci.USA，764350-4354(1979)和Ceriani等人报告的固相结合测定法(Cerianietal.，MonoclonalAntibodiesandFunctionalCellLines，PlenumPress，NewYork，398-402(1984)测定经BrE2单克隆抗体鉴定的抗原的分子量。在WesternBlot试验法中，用7%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离HMFG，然后将HMFG电印迹法转到硝化纤维素膜上。将硝化纤维素膜切成条状，恒温保温该条。高分子量标准品同时在凝胶上平行段泳动。在固相结合测定法中，如LaemmliVK在自然杂志227期第680页(1970)描述那样，HMFG在7%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。凝胶道被切成许多片段，洗脱该切片，然后将洗提液干燥在微量滴定板上。使用放免结合测定技术检测单克隆抗体的结合情况。在使用WesternBlot试验法和固相结合测定法电泳HMFG的时侯，只能在聚丙烯酰胺凝胶的原点找到BrE2单克隆抗体鉴定一种物质。因此，由BrE2单克隆抗体识别的粘蛋白样糖蛋白抗原也保留在原点，而不穿透聚丙烯酰胺凝胶。使用固相结合测定法在少于7%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳HMFG。然后用高分子量标准品计算由BrE2单克隆抗体识别的粘蛋白样糖蛋白抗原的分子量。这样抗原的分子量估计超过400，000道尔顿。在BrE2和Mc5单克隆抗体之间进行一些实验，以判断它们对于糖蛋白抗原的竞争。发现BrE2单克隆抗体对与Mc5单克隆抗体结合的同一抗原决定簇不具有竞争性结合。用BrE2单克隆抗体对含有乳腺癌细胞或分子的体液分析表明，我们确定对小于400，000道尔顿分子量的糖蛋白分子实体也发生结合。推测被BrE2单克隆抗体结合的高分子量的粘蛋白样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经杂交瘤技术制备的，对人乳腺癌细胞质内及细胞表面，人类其它腺癌癌细胞质内及细胞表面和人类正常乳腺上皮细胞表面上的特有的抗原决定簇能产生特异性的单克隆抗体的细胞系。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯托L瑟列尼，杰里A彼得森，
申请(专利权)人：约翰缪尔纪念医院约翰缪尔癌与老年研究所，
类型：发明
国别省市：US[美国]