[B9谷氨酸,B10门冬氨酸]人胰岛素制造技术

本发明专利技术为一种利用蛋白质工程方法获得的人胰岛素－－［Ｂ９Ｇｌｕ，Ｂ１０Ａｓｐ］人胰岛素，其特征在于Ｂ链第９位与第１０位均为酸性氨基酸，［Ｂ９Ｇｌｕ，Ｂ１０Ａｓｐ］人胰岛素的受体结合能力为猪胰岛素的３４．４％，体内生物活力则与天然胰岛素基本相同。本发明专利技术很有希望作为单体速效胰岛素应用于临床。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
作为治疗糖尿病的特效药，胰岛素应用于临床已有70多年，是临床上用量最大的蛋白质类药物。胰岛素的生理功能在於保持人正常的血糖水平。通常，饭后30-60分钟内血胰岛素达到高峰，120-180分钟内恢复到基础水平，与进餐后的血糖高峰协调一致。目前临床上使用的含锌胰岛素制剂主要以六体等多聚体形式存在，而胰岛素是以单体形式表现其生理功能。因此，注射到皮下后需逐渐解离成单体，120分钟血中才出现高峰，并且此峰值一直持续到180-240分钟，造成病人一段时间内因血中胰岛素浓度过低而出现高血糖症状，随后又因血胰岛素浓度过高而表现为低血糖(Brange J，et al.，Diabetes Care，1990，13923)。为了改善这种状况，改进胰岛素性能，以得到能迅速降低血糖水平的单体胰岛素制剂已成为临床治疗的迫切需要(Brange J，et.al.，Nature，1988，333679；Brange J，et al.，Cur Opin Struct Biol，1991，934)。胰岛素单体聚合为二体时由B12Val、B24与B25Pne、B16与B26Tyr等组成的疏水面、B链羧端反平行β折叠以及其它一些氢键等参与作用。三个二体依靠极性和非极性作用，以及配位键形成六体。因此，改变参与形成二体的氨基酸残基以阻碍二体的形成，即有可能获得单体胰岛素类似物。胰岛素的三维结构分析表明，B9Ser位于形成胰岛素二聚体的疏水面内(Baker EN，et al.，Phi Trans Roy Soc London B.，1988，319369)，基于此，Brange等(Nature，1988，333679)将B9的Ser改为Asp，以排斥二聚体的形成，获得在药剂浓度下以单体形式存在的胰岛素，成为临床需要的速效胰岛素(Kang S，et al.，Lancet，1990，335303)，本实验室用Glu取代B9Ser，得到了类似的结果。但它们的生物活力明显降低，约为天然胰岛素的二分之一。此外，本实验室用Asp代替B10His获得高活力人胰岛素。Burke等(Biochem Biophys Res Comm，1990，173982)用化学合成方法比较了一系列与B10Asp组合的胰岛素类似物，发现B10His被Asp取代后，能普遍提高相应的胰岛素类似物的生物活力。基于以上结果，本专利技术利用蛋白质工程方法制备了单体胰岛素类似物——人胰岛素，其中X、Y均为酸性氨基酸(具体实施为人胰岛素；含猪胰岛素前体(porcine insulinprecursor，PIP)突变基因的表达型质粒的酵母菌株Saccharomycescerevisiae YS92/pLLPIP(XV-700-6B)(CCTCC N0.M95042)已保藏在中国典型培养物保藏中心(中国·武汉·武汉大学校内)。人胰岛素的受体结合能力为猪胰岛素的34.4％，体内生物活力则与天然胰岛素基本相同。因此，本专利技术可望作为单体速效胰岛素应用于临床。本专利技术的技术特征在下述的实施例中作具体描述。本专利技术的附图作以下说明附图说明图1.猪胰岛素前体(PIP)基因的突变。图2.突变胰岛素B链改变区域的DNA序列图谱。图3.表达产物在Sephadex G-50柱(2.6×160cm)上的层析图谱。峰3为PIP。图4.聚丙烯酰胺凝胶电泳(pH8.3)图谱。图4(a).Sephadex G-50纯化之PIP(A)及进一步经HPLC纯化的PIP(B)。图4(b).B30Thr(But)-OBut人胰岛素(A)；人胰岛素(B)；对照(C)上面条带为B30Thr(But)-OBut人胰岛素，靠下条带为猪胰岛素。图5.胰岛素HPLC图谱。图5(a).纯化的PIP。图5(b)人胰岛素。图6.转肽反应混合物的HPLC图谱。图7.人胰岛素(o-o)和猪胰岛素(x-x)与人胎盘细胞膜胰岛素受体的结合曲线。实施例1.猪胰岛素前体(PIP)基因的突变采用标准的克隆步骤(Sambrook J，et al.(eds.)MolecularcloningA laboratory manual，1989，2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，New York)，突变的原理与步骤如图1所示。大肠杆菌JM103在2YT培养基中生长，用氯化钙方法转化。质粒pVT102-U为Thierry Vernet(Biotechnology Research Institute，Montreal)所赠，Saccharomyces cerevisiae XV700-6B(Leu2，Ura3，Pep4)为Michael Smith(University of British Columbia，Vancouver)所赠，在YPD培养基中生长，用醋酸锂方法转化。转化的酵母细胞用选择培养基(2％琼脂，0.75％酵母含氮碱基，2％葡萄糖和各100μg/ml的氨基酸)选择。突变引物为5′-CTTGTGCGGTGAAGACTTGGTTGAGGC-3′，其中B9Ser和B10His密码子TCC和CAC，在引物中分别用Glu和Asp的密码子GAA和GAC代替。含尿嘧啶单链DNA按Sambrook等(Sambrook J，et al.(eds.Molecular cloningA laboratory manual，1989，2nd ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)方法制备，参照李等(李亦平等，生物工程学报，1987，390)方法，用缺口双链DNA方法进行基因的定位突变。按Sanger等(Sanger FG，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1977，475463)方法测定突变子的DNA顺序，结果表明突变已正确发生(图2)。并将它转化到酵母菌。含突变基因的表达型质粒的酵母菌珠Saccharomyces cerevisiae YS92/pLLPIP(XV-700-6B)(CCTCC NOM95042)已保藏在中国典型培养物保藏中心(中国·武汉·武汉大学校内)。实施例2.PIP在酵母中的分泌表达及产物的分离纯化将转化的酵母细胞接种于5ml不含琼脂的YPD培养基中，30℃培养一天后转接到250mlYPD培养基，30℃继续培养两天表达PIP，表达产物分泌于发酵液中，表达量用胰岛素放射免疫药盒(上海生物制品研究所产品)测定。离心去菌体，用三氯乙酸沉淀，沉淀用离心收集后溶解并通过SephadexG-50柱(2.6 x 100cm)分离，用1mole/L醋酸洗脱。收集PIP峰，冻干，进一步用HPLC分离获得HPLC纯(图5a)和电泳纯(图4a)的PIP。实施例3.PIP的胰蛋白酶转肽及人胰岛素的鉴定将纯化的PIP溶解於1，4-丁二醇/二甲基亚砜/水(体积比70∶15∶15)，PIP的浓度为50mg/ml，加克分子过量100倍的Thr(But)-OBut)。将溶液pH调至6.5，加TPCK-胰蛋白酶(为PIP重量的五分之一)。反应液在25℃保温6小时，加丙酮使蛋白质沉淀。用半制备柱RP-300在Beckman HPLC仪器上分离(图6)，其中峰1为未反应的PIP，峰2为去B本文档来自技高网...

【技术保护点】
［Ｂ９Ｇｌｕ，Ｂ１０Ａｓｐ］人胰岛素，其特征在于胰岛素的Ｂ链第９位与第１０位氨基酸均为酸性氨基酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：冯佑民，梁镇和，唐月华，刘滨，张友尚，
申请(专利权)人：中国科学院上海生物化学研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]