微生物同步发酵正十三烷生产十一烷1,11二羧酸方法技术

本发明专利技术公开了一种利用微生物同步发酵正十三烷（ｎＣ↓［１３］）高产十一烷１，１１－二羧酸（ＤＣ↓［１３］）的方法。所用微生物为一株热带假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）优良生产突变株Ｐ－１２－２４２。其特点是：在微生物菌种接入含有Ｃ↓［１１］－Ｃ↓［１８］各种正烷烃为基质的培养基后，２８小时内，ｐＨ控制在６．８以下，以菌体生长为主，产生一定数量二元酸；２８－６０小时，ｐＨ控制在７．３，以下，以产酸为主，增长一定量菌体；６０小时以后ｐＨ控制在７．５－７．８，迅速生产各种二元酸。当本方法用于ｎＣ↓［１３］发酵生产ＤＣ↓［１３］时，在２．５ｍ↑［３］发酵罐内，１６１小时，ＤＣ↓［１３］高达２０５ｇ／Ｌ，转化率达到９４％，ＤＣ↓［１３］的纯度达到９６－９７％。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物同步发酵正烷烃生产长链α，ω-二元酸的方法，尤其是发酵正十三烷(nC13)高产十一烷1，11-二羧酸(DC13)的方法。C10以上的长链二元酸是化工上合成高级香料，高级尼龙工程塑料，高档服装用尼龙热熔胶，高温电介质，高级涂料，润滑油添加剂和耐寒性增塑剂等的重要原料。尤其是十三碳二元酸(DC13)和十五碳二元酸(DC15)，它们分别是合成日用香料麝香T和名贵香料麝香酮的重要原料。C10以上的长链二元酸，在自然界中不单独存在，只有少数几种二元酸可从植物油中裂介制取，例如癸二酸(DC10)可从蓖麻籽油裂介制取；DC13可从菜籽油中抽提出甘油芥酸酯再用臭氧氧化方法生产；DC15可从蒜头果油中的脑神经酸裂介制取。但它们都受农田和气候的限制，远不能满足需要。化工上至今也还没有经济可行的合成路线和方法。微生物学家应用生物工程技术，利用微生物发酵石油中的正构烷烃生产相应链长的二元酸，弥补了化工上的不足，开辟了长链二元酸的新来源。七十年代以前，各国科学家对微生物发醇生产二元酸的研究，只处于理论研究阶段，所产生和积累的二元酸也都是十个碳以下的短链二元酸，七十年代以后，进入应用研究阶段，通过大量的菌种诱变筛选，培育出一批新突变菌株，能从十个碳以上的正烷烃产生和积累与基质链长相同的长链二元酸，并通过不断的培育和代谢调控研究，使每升发酵液中二元酸的积累从开始时的几克，十几克，几十克提高到目前的一百多克和二百克左右。八十年代以来，二元酸的研究进入小规模工业生产阶段，并出现了几个有实际生产价值的专利文献。中国专利87105445.0，CN1046757A，CN1092108A和CN1130685A分别提出生产长链α，ω-二元酸的方法，特别是分别高产DC16，DC17，DC15和DC12的方法。在16升自动控制罐中，发酵5天，DC16为123g/L，发酵6天，DC17为133g/L，在2.5m3通用式发酵罐中，发酵6天，DC15为178g/L，在3m3发酵罐中，发醇5天，DC12为145g/L。对DC13的研究，日本矿业株式会社率先工业放大，1984年建成年产200吨的DC13的工业发酵装置，并投入生产。中国专利CN1071951A提出一种微生物异步发酵生产长链α，ω-二元酸的方法，尤其是生产DC13的方法。其方法是分两步进行，根据实验例4，第一步是把培养好的600升菌种液接入装有正十三烷(nC13)125升和培养基1775升的3m3发酵罐内(即装液量为83％)，控制PH在4.5±0.1，繁殖培养菌体，24小时，菌体浓度达到8.7％(湿菌重)；第二步，补加20％(V/V)的nC13，调PH至7.8±0.1，转入发酵产酸阶段，发酵72小时，DC13达到98.2g/L，继续发酵72小时，产酸达到166.3g/L(从接种开始到发酵结束，共168小时)，转化率为84％。本专利技术的目的是提出另一种利用微生物同步发酵正烷烃生产C11-C18长链α，ω-二元酸的方法，尤其是高产DC13的方法。本专利技术所用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)P-12-242，是以一株氧化正烷烃生产混合二羧酸的热带假丝酵母(参见《微生物学报》20(1)88-93，1980)为出发菌株，通过亚硝酸和紫外线的多次反复诱变筛选培育出来的，能从C11-C18的各种单一正烷烃和混合正烷烃，尤其是正十三烷，高产出地生产相应链长的二羧酸。热带假丝酵母P-12-242(以下简称P-12-242)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.。P-12-242的生理特性如下一、糖类的发酵葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。二、同化葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松三糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤藓醇-，甘露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁二酸钠+，乳酸钙-。三、生长素的需要生物素++，维生素B1++，维生素B2+，维生素B6+，维生素B12+，叶酸+，烟酸+，泛酸+，肌醇+，对氨基苯甲酸+。四、其它硝酸盐-，冻化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。形态特征奶油白色，皱褶型，菌落为蛋糕状和桃酥状。培养特征在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长；在烷烃种子培养基中培养时，有一定数量的短假菌丝；而在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭园细胞。本专利技术的种子培养基(1)、10个巴林糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；(2)、10个巴林的麦芽汁液体培养基；(3)、烷烃种子培养基包含KH2PO46-12g/L，玉米浆3-8g/L，酵母膏3-8g/L，蔗糖3-8g/L，尿素3-6g/L，重蜡40-70ml/L，自来水配制，自然PH。培养种子的过程为取一接种环P-12-242酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上(15×180试管，每支装6-7mL培养基，放成斜面)，于28-30℃培养40小时。取一支上述培养好的P-12-242菌种分部刮入装有25ml烷烃种子培养基的250mL三角瓶中，于28-30℃220转/分的旋转摇床上培养40-48小时，作为摇瓶发酵种子或者取两支上述培养好的P-12-242菌种全部刮入装有500mL培养基的5000ml三角瓶中，于180转/分旋转摇床上28-30℃培养44-48小时，作为一级种子罐的种子。用本专利技术的P-12-242菌株生产长链二羧酸，特别是十三碳二羧酸的具体方法是把发酵的种子接入PH5.5-9.0，最好为6.5-7.5的含有15-45％(V/V)的C11-C18的正烷烃和85-55％(V/V)发酵培养基的混合液中。发酵培养基的组成为碱金属磷酸盐6-14g/L，最好为7-10g/L，氯化钠0.5-2.0g/L、酵母膏1-6g/L，最好为3-5g/L，玉米浆0.5-2g/L，尿素0.5-2.5g/L最好为1.0-2.0g/L，硝酸盐5-15g/L，最好为6-12g/L，蔗糖10-30g/L，最好为10-20g/L，消泡刘400-1200ppm以及一些其他公知的营养源，在PH5.8-7.5之间将上述混合物在25-30℃，最好在27-31℃通气发酵48-170小时。28小时内，PH控制在6.8以下，以菌体生长为主，产酸为付，此时菌株生长光密度OD达到0.6左右，产酸达到20-30g/L，在28-60小时，PH控制在7.3以下，产酸为主，菌体生长为付，此时OD达至0.9左右，产酸达到75-85g/L，从60小时以后，每隔6-8小时用NaOH溶液调一次PH至7.5-8.0，菌体量不再增加，而产酸量继续迅速增加，然后将产生的二羧酸从发酵液中分离出来。在发酵开始时，混合液中正烷烃含量为10-20％(V/V)，以后在适当时间补加正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(V/V)为准。碱金属磷酸盐可从KH2PO4，NaH2PO4K2HPO4和Na2HPO4中选一种。硝酸盐可从钾或钠盐中选一种。发酵结束后，加入适量的水，加碱至PH10-12，加热至85-90℃，进行破乳分层，上层为残油，回收再用，放本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用微生物同步发酵正烷烃生产Ｃ↓［１１］－Ｃ↓［１８］各种长链α，ω一二元酸的方法，其特征在于以正十三烷（ｎＣ↓［１３］）为基质的培养基中，用热带假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）Ｐ－１２－２４２，即ＣＧＭＣＣ ＮＯ．０２９７发酵，然后回收所形成的二元酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈远童，庞月川，郝秀珍，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]