胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，属于蛋白工程技术领域，菌种的纯化与保藏、活化与扩培；摇瓶、种子罐的种子培养；发酵罐内菌体培养与甲醇驯化、初始诱导阶段与混合加大诱导阶段；发酵液后处理后，得到胶原蛋白。本发明专利技术采用诱导剂、低温、高动力的混合加大诱导模式，与用单一阶段添加诱导剂进行诱导相比，菌体对碳源甲醇有更好的适应过程，生物量得到了进一步的积累，循序渐进，逐渐加大诱导强度，目标蛋白的产量大量提高；与单一用温度诱导的方式相比，保证了目标胶原蛋白的正确折叠，同时提高动力条件满足了菌体在诱导表达阶段对溶氧的大量需求，提高了目标胶原蛋白的表达产量，同时又不会造成菌体中毒现象的发生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白工程
，具体涉及一种胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方 法。
技术介绍
胶原蛋白又称胶原，是胞外基质中的基本蛋白成分，广泛分布于人体各个器官和 组织，如皮肤，血管、骨骼和软骨等，尤其在人体的皮肤和结缔组织中，含有大量的胶原蛋 白，皮肤细胞外基质中约70 % -80 %为胶原蛋白，其在人体的总含量约占人体蛋白质总量的 25%-33%，这些蛋白质对维护细胞、组织、器官的正常生理功能有非常重要的作用。胶原蛋 白具有非常复杂的特殊超螺旋结构，由Gly-X-Pro为基本重复体构成左手螺旋，X为其他氨 基酸残基，缺乏色氨酸，胶原分子呈纤维状，由三条肽链拧成，三条肽链均无链内氢键，仅受 链间氢键支撑。胶原蛋白具有无毒、止血、易吸收、非抗原、生物相容性和可生物降解等特 性，应用非常广泛，尤其在美容和医学领域，已成功应用于化妆品、矫形、保健、烧伤、创伤、 组织修复、创面止血等方面，故胶原蛋白的生产是近年来生物和化学领域研究的热点。 胶原蛋白传统的生产方法是通过酸溶法、碱溶法、中性溶解法或者酶溶法从动物 来源(猪、牛、驴、鱼等)的组织和器官，比如皮肤、软骨、骨骼等提取和纯化，但提取出来的胶 原蛋白水溶性差、纯度低，并且存在着病毒反应和人体排异反应。为了解决这一难题，利用 生物技术手段进行对微生物进行基因重组的改造成为了主流，目前胶原蛋白已成功的在多 种宿主中得到了表达，主要有大肠杆菌、酵母菌等。但是由于细菌表达具有诸多弊端，比如 内毒素、热源等安全问题，蛋白以包涵体的形式存在于细胞内，提取纯化困难，而在毕赤酵 母中具有较高的分泌表达特性，目前在毕赤酵母表达过程中，诱导的模式是添加诱导剂甲 醇，而甲醇对菌体具有一定的毒害作用，其量应该要严格准确的控制，量少诱导强度不够， 蛋白产量低，量多会对菌体产生毒害作用，使一部分菌体细胞自溶死亡，从而给后期提取纯 化带来很大的麻烦，故而蛋白表达量受到了诱导剂甲醇很大的限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够克服甲醇对蛋白高效表达的限制，生产成本低，并 适用于工业化大规模生产的。 本专利技术所使用的菌种为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)SMD1168保藏编号： 〇6皿〇：如.7189保藏时间为2013.01.29分类命名：巴斯德毕赤酵母(？丨(^丨3?38如48) SMD1168保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源，醇氧化酶利用氧分子 将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢，为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞 器一过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其他组分，由于醇氧化酶与氧分子 的结合率低，因而毕赤酵母代偿性的产生大量的酶，而调控产生醇过氧化物酶的启动子也 正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。毕赤酵母经过快速生长阶段之后，菌体已 经得到了大量的积累，满足了进行诱导表达的生物量条件，由于甘油是作为生长阶段的碳 源，而诱导表达阶段所采用的唯一碳源和能源是甲醇，同时也是使菌体表达蛋白的诱导剂， 所以涉及到碳源的代谢转换，故本专利技术采用分阶段诱导，使毕赤酵母更好的适应诱导剂甲 醇。本专利技术的目的是提供一种能够克服甲醇对蛋白高效表达的限制，生产成本低，并 适用于工业化大规模生产的。本专利技术，包括以下步骤： (1)菌种的纯化与保藏、活化与扩培； (2)摇瓶、种子罐的种子培养； (3)发酵罐内菌体培养与甲醇驯化、初始诱导阶段与混合加大诱导阶段；甲醇驯化过程为：第一阶段加入甲醇，使发酵罐溶氧下降至16 %-20 %，维持时间3_4h，之后溶氧回 升;第二阶段加入甲醇，使发酵罐内溶氧下降至15%_20%，维持时间2-3h;初始诱导阶段过程为：调节发酵罐内的温度为28°c，采用间歇式恒速流加甲醇，控制溶氧在18%-22%， 设置搅拌转速为650rpm，流量为1L/(L·min)，罐压为0.05MPa并保持不变，待生物量达到 240-260g/L时此阶段结束； 混合加大诱导阶段为： 调整发酵罐内温度为25°C，将通气流量由1L/(L·min)提高至1.3L/(L·min)，罐 压升高至〇.〇7MPa_0.09MPa，加大甲醇的流加速率以维持18%-22%的溶氧，一直维持到发 酵结束，菌体湿重维持恒定或下降幅度超过20g/L，此阶段结束； (4)将步骤(3)所得的发酵液后处理后，得到胶原蛋白。所述甲醇驯化过程中第一阶段发酵罐内控制甲醇的浓度为0.3%，第二阶段发酵 罐内控制甲醇的浓度为〇. 5 %。 所述种子罐的种子培养基和发酵罐内菌体培养基为改良后的FBS培养基，其配方 为：所述初始诱导阶段采用间歇式恒速流加甲醇，流加速率是3.55-3.95ml/h/L。 所述混合加大诱导阶段甲醇的流加速率为9.0-9.30ml/h/L。 所述后处理包括离心去菌体、缓冲液抽提、盐析、离子交换、柱层析精制和冷冻干 燥，细胞经离心后获得上清液，然后加入甲酸缓冲液进行抽提，盐析粗提，用离子交换树脂 吸附以〇. 5mol/LNaCl、20mMTrispH8.0洗脱后，再用金属螯合柱吸附、洗脱，收集蛋白冷冻 干燥，即可获得胶原蛋白样品。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于： (1)本专利技术采用巴斯德毕赤酵母基因工程菌表达人胶原蛋白，生长繁殖快，醇氧化 酶基因的启动子具有强诱导性和启动性，与动物来源的产品相比无病毒隐患，与原核生物 表达体系相比，其表达载体不是以游离质粒形式存在，而是整合到染色体上，菌株十分稳 定，同时毕赤酵母为分泌表达，易于后期纯化，培养基大部分为无机盐，价格低廉，适合大规 模发酵生产； (2)本专利技术与用单一阶段添加诱导剂进行诱导相比，菌体对碳源甲醇有更好的适 应过程，在此基础上，进入初始诱导阶段，兼顾生长与表达，生物量得到了进一步的积累，最 终进入蛋白的大量表达阶段，即混合加大诱导阶段，循序渐进，逐渐加大诱导强度，在菌体 很好的适应诱导剂的同时，目标蛋白的产量也得到了大量的提高;菌体未出现自溶，发酵液 未大量出现泡沫;与单一用温度诱导的方式相比，保证了目标胶原蛋白的正确折叠，同时提 高动力条件满足了菌体在诱导表达阶段对溶氧的大量需求，加大了诱导的强度，提高了目 标胶原蛋白的表达产量，同时又不会造成菌体中毒现象的发生，最终使发酵单位提高了 18%-20%，诱导剂利用率提高了 7%-15%。【附图说明】图1为本专利技术不同诱导方式的结果比较图，坐标轴X上1，2,3分别代表单纯用诱导 剂诱导、诱导剂加低温诱导，混合加大诱导；图2为不同诱导方式甲醇利用率的比较图，坐标轴X上1，2,3分别代表单纯用诱导 剂诱导、诱导剂加低温诱导，混合加大诱导。【具体实施方式】 以下结合实施例对本专利技术做进一步详细的描述。 实施例1本专利技术，包括以下步骤： (1)菌种的纯化与保藏、活化与扩培； (2)摇瓶、种子罐的种子培养； (3)发酵罐内菌体培养与甲醇驯化、初始诱导阶段与混合加大诱导阶段； 发酵罐内菌体培养：配FBS培养基，校正pH电极，校正溶氧电极，灭菌，降温到30°C，注意水分蒸发损失。 插入补料瓶:氨水瓶、消泡剂瓶。补料50 %的甘油、甲醇;校正蠕动栗，精确计量进样体积;设 置转速300rpm，空气通气量1.0L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种的纯化与保藏、活化与扩培；(2)摇瓶、种子罐的种子培养；(3)发酵罐内菌体培养与甲醇驯化、初始诱导阶段与混合加大诱导阶段；甲醇驯化过程为：第一阶段加入甲醇，使发酵罐溶氧下降至16％‑20％，维持时间3‑4h，之后溶氧回升；第二阶段加入甲醇，使发酵罐内溶氧下降至15％‑20％，维持时间2‑3h；初始诱导阶段过程为：调节发酵罐内的温度为28℃，采用间歇式恒速流加甲醇，控制溶氧在18％‑22％，设置搅拌转速为650rpm，流量为1L/(L·min)罐压为0.05MPa并保持不变，待生物量达到240‑260g/L时此阶段结束；混合加大诱导阶段为：调整发酵罐内温度为25℃，将通气流量由1L/(L·min)提高至1.3L/(L·min)，罐压升高至0.07MPa‑0.09MPa，加大甲醇的流加速率以维持18％‑22％的溶氧，一直维持到发酵结束，菌体湿重维持恒定或下降幅度超过20g/L，此阶段结束；(4)将步骤(3)所得的发酵液后处理后，得到胶原蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金伟，
申请(专利权)人：山东鲁抗医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37