用于生产γ-癸内酯的方法技术

本发明专利技术涉及采用含Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ的培养物制备γ癸内酯的方法。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于制备γ-癸内酯的新型方法。γ-癸内酯因其器官感觉特性而是一种重要的芳香化合物，它带有水果味、桃样香味和芳香性。一般来说，可以由水果生产γ-癸内酯。然而，它在水果中的含量极少，使得不能通过提取或蒸馏的方法经济地分离它。因此，近年来已经进行了大量尝试以生物技术方法来制备γ-癸内酯。大部分方法使用各种酵母进行。在这种情况中，通过酵母转化从其中分离的蓖麻油或蓖麻油酸的甲基酯。在该方法中在75小时内获得的产量在几毫克/升到9.4g/l之间改变(FR2 734 843)。此外，这种方法具有使用尿嘧啶-营养缺陷型物质的缺点且由此两个分离步骤是生物量形成和产生所必不可少的。本专利技术的目的由此是提供一种尽可能提高产量的方法。通过使用含有Yarrowia lipolytica的培养物可以达到这一目的。按照本专利技术，能够在含有其它微生物的混合物中使用Yarrowialipolytica。然而，优选将Yarrowia lipolytica用作纯培养物。本专利技术特别优选培养菌株Yarrowia lipolytica HR145(DSM12397)。作为本专利技术所用的培养物底物，可以使用合成、半合成或复合的培养基。它们包括碳化合物和氮化合物、无机盐、微量元素或不含微量元素和维生素。作为碳化合物，优选可以使用碳水化合物、烃类或有机碱化学物质。可以优选使用的化合物的实例是糖类、醇类和/或糖醇类、有机酸类或复合的混合物。根据本专利技术，优选油类。作为糖，优选使用葡萄糖。可用的醇类优选包括甘油或甘露糖醇。可以使用的有机酸类优选是柠檬酸。复合的混合物包括例如麦芽汁、酵母提取物、酪蛋白或酪蛋白水解物。作为油，特别可以使用蓖麻油。在这些情况中，根据本专利技术，可以使用两种或多种所述化合物的混合物。作为含氮底物，可以使用无机化合物。它们的实例是硝酸盐和铵盐。同样，可以使用有机氮源。它们包括酵母提取物、大豆粉、棉子粉、酪蛋白、酪蛋白水解物、面筋和玉米浆。还能够使用两种或多种所述的化合物作为混合物。可以使用的无机盐包括例如硼酸盐、碳酸盐、氯化物、钼酸盐、硝酸盐、磷酸盐和硫酸盐。作为金属，所述的盐优选含有钙、铁、钾、钴、铜、镁、锰、钠或锌。根据本专利技术，还可以使用两种或多种所述盐的混合物。培养温度优选在10-40℃的范围。特别优选的范围在20-35℃，极为优选的范围在25-30℃。培养基的pH优选为4-9。特别优选的范围在5-8。在生产过程中，充分通气是必要的。可以由此设计本专利技术可以使用的反应器。一般来说，根据本专利技术，由此可以使用适合于需氧方法且本领域技术人员公知的所有生物反应器。优选可以使用任何适合于需氧浸没方法的所有装置。即根据本专利技术，可以使用不带有或带有机械混合装置的容器。例如，前者包括振荡器、泡罩塔(Blasensulen)反应器或环路(Schlaufen)反应器。后者优选包括所有公知带有以任意方式设计的搅拌器的装置。本专利技术的方法可以连续进行或间歇式进行。直至达到最大量产物的发酵时间在36-72小时的范围，优选48-66小时的范围，根据接种的培养物来计算。根据本专利技术，在接种的开始阶段、生长过程中或生长完全后加入底物。这可以通过一次添加底物或通过在该过程中连续依次添加底物来实现。然而，优选在接种培养物后许多小时的期限内进行连续添加。使用本专利技术所述的方法令人意外地能够在低于70小时内生产11g/l以上的γ-癸内酯。通过下列实施例来更具体地描述本专利技术和相关的令人意外的发现。给带有侧颈的两个500ml锥形瓶中装入培养基(1.461g的Na2HPO4×12H2O、0.352g的KH2PO4、0.53g的脲、0.07g的Tween 80、5g的酵母粉、1g的蓖麻油和100ml的水)并将其在121℃下的高压灭菌器内灭菌15分钟。在冷却至室温后，给各烧瓶中接种500μl的Yarrowialipolytica HR145麦芽汁肉汤培养物。在27℃和100rpm下在回旋机上将烧瓶培养24小时。2．在10l发酵罐内生产γ-癸内酯将9.8l水装入发酵罐并向其中加入14.61g的Na2HPO4·12H2O、53g的脲、50g的MgSO4·7H2O、0.04g的核黄素、500g的酵母粉、7.0g的Tween 80、100g的蓖麻油和5g的消泡剂。在121℃下将该培养基在原位灭菌30分钟。此外，在高压灭菌器内将稀氢氧化钠溶液和硫酸以及蓖麻油各500g灭菌。冷却后，使消泡剂探头与NaOH的放液接头连接。在灭菌后pH约为pH7.9。用稀硫酸将pH调节至7.0。搅拌速度为400rpm；通气量为3l/分钟的压缩空气；温度为27℃。通过无菌放液接头给所述发酵罐中接种初级培养物。在发酵过程中，进一步加入氢氧化钠溶液以便将pH保持在pH7.0。根据需要自动添加消泡剂。接种14小时后，开始添加底物。在4小时过程中添加500g的蓖麻油。在约52小时的发酵时间后，终止发酵。当不再添加更多的氢氧化钠溶液1小时时，达到终止发酵的时间。为了终止发酵，使用浓硫酸将发酵罐内含物的pH调至pH2.0并加热至80℃30分钟。冷却后，压榨出内含物用于随后的检测。根据HPLC,γ-癸内酯的终浓度为11,500-12,500ppm。3-羟基-γ-癸内酯与γ-癸内酯之比小于0.2。在离心后如果合适，通过公知的物理方法(蒸馏法、提取法等)从所得的培养物肉汤中分离γ-癸内酯。3．300l规模的生产如实施例1中所述精确制备200ml的初级培养物并用于接种300l发酵罐。将140l水预先加入所述发酵罐并向其中加入742g的脲、49g的KH2PO4、12g的H2O、7g的酵母提取物和98g的Tween80。在121℃下将该培养基在原位灭菌30分钟。冷却后，使消泡剂探头与NaOH的放液接头连接。在灭菌后pH约为7.0。将搅拌速度设定为180rpm；通气量达35l/分钟且温度为27℃。在无菌条件下给所述发酵罐中接种200ml的初级培养物。在发酵过程中，使用氢氧化钠溶液将pH保持在7.0的恒定值。接种约16小时后，开始添加蓖麻油(7.4kg)且再过4小时后完成添加。在69小时的发酵时间后，终止发酵。γ-癸内酯的终浓度为12.3g/l。由于仅形成了1.53g/l的3-羟基-γ-癸内酯，所以3-羟基-γ-癸内酯与γ-癸内酯之比为0.125。权利要求1．在生物反应器内制备γ-癸内酯的方法，其特征在于使用含有Yarrowia lipolytica的培养物。2．根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用由Yarrowialipolytica组成的纯培养物。3．根据权利要求1或2之一所述的方法，其特征在于使用Yarrowia lipolytica HR 145(DSM 12397)。4．根据权利要求1-3中之一所述的方法，其特征在于使用合成、半合成或复合的底物。5．根据权利要求1-4中之一所述的方法，其特征在于使用含有碳化合物或氮化合物、无机盐、微量元素和/或维生素的底物。6．根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述底物中含有的碳化合物是糖类、糖醇类、醇、有机酸类、复合混合物、油类或这些物质中的两种或多种的混合物。7．根据权利要求6所述的方法，其特征在于所用底物中含有葡萄糖、甘油、甘露糖醇、柠檬酸、麦芽汁、酵母提取物本文档来自技高网...

【技术保护点】
在生物反应器内制备γ－癸内酯的方法，其特征在于使用含有Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ的培养物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J拉本霍尔斯特，I加特菲尔德，
申请(专利权)人：哈尔曼及赖默股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]