生产赤藓糖醇的酵母菌株制造技术

本发明专利技术涉及能将葡萄糖转变为赤藓糖醇的酵母菌株，所述菌株具有下列鉴定特征：缺乏能动孢子；有隔菌丝体；无性繁殖；缺乏肾形细胞；分生孢子任选在短的小齿而不是长柄上形成；缺乏掷分生孢子；在宽基上非－单极出芽；顶生的芽分生孢子链；深棕色，厚壁的厚壁孢子；同化蔗糖、甘油和麦芽糖的能力；不能同化乳糖；不能发酵半乳糖；和能在２５℃－３６℃生长。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
赤藓糖醇属糖醇类，其甜度为蔗糖的60％至80％，但其热值仅约为蔗糖的1/10，且不会引起龋齿。与很多糖醇不同的是，它不会导致腹泻。另外，赤藓糖醇具有极好的加工特性它是热稳定的；不与氨基基团反应，因此不会导致有机物变为褐色。赤藓糖醇可见于地衣、长纤维植物叶、菌类植物、发酵食品(如葡萄酒和酱油)和微生物中。可生产赤藓糖醇的微生物包括毕赤氏酵母属、假丝酵母属、球拟酵母属、三角酵母属、Moniliella、短柄霉属和丝孢酵母属的酵母菌株。本专利技术涉及能在简单培养基中将葡萄糖转变为赤藓糖醇的新的酵母菌株。本专利技术酵母菌株的特征在于缺乏能动孢子或游动孢子(即，具有鞭毛的孢子)；具有有隔菌丝体(即，具有分壁的菌丝体)；无性繁殖(即，不涉及kasogamy和减数分裂的繁殖)；缺乏肾形细胞；分生孢子任选在短的小齿(即，小的齿状突出物)而不是长柄上形成；缺乏掷分生孢子(即，强行释放的分生孢子)；在宽基上非-单极出芽(即，单极突起不产生新细胞的增殖过程)；顶生的芽分生孢子链(即，特征在于在原始细胞被隔片定界之前，可辨认的分生孢子原始细胞显著变大)；深棕色，厚壁的厚壁孢子(即，通过原生质体的收缩，无性1-分室孢子各内源性地和独自地来源自预先存在的细胞的一部分)；有发酵能力(即，半厌氧地发酵至少一种碳源的能力)；能同化蔗糖、甘油和麦芽糖；不能同化乳糖；不能发酵半乳糖；能在25℃，30℃，35℃和36℃生长。任选地，本专利技术酵母菌株的特征还在于能发酵蔗糖，葡萄糖(即，D-葡萄糖)或麦芽糖；或能或不能同化半乳糖。根据下文实际的实施例中描述的方法可测定菌株能否发酵或同化特定的碳源，能否在不含维生素的培养基中生长，能否在特定的温度下生长。本专利技术的范围中还欲包括具有特征在于上述形态学性状和下表1，2，3，4，5或6中所述生理学性状的酵母菌株。其实例包括但不限于于2000年1月27日保藏于美国典型培养物保藏中心(10801 UniversityBlvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA)的6个菌株。保藏菌株的保藏号为PTA-1227，PTA-1228，PTA-1229，PTA-1230，PTA-1231和PTA-1232。衍生自保藏菌株的突变体也在本专利技术的范围之内。本专利技术的酵母菌株与Moniliella acetobuten最接近。实际上，它们的上述形态学性状与M.acetobuten一致。另一方面，它们的生理学特征与M.acetobuten的差别很小。例如，与M.acetobuten不同的是，本专利技术的菌株不能同化乳糖。另外，它们能在简单培养基(如仅含葡萄糖和酵母浸膏)中，以比M.acetobuten高得多的速率将葡萄糖转变为赤藓糖醇。从下列详细描述(包括实施例)和所附权利要求书中显而易见本专利技术的其它特征或优点。本专利技术的酵母菌株可分离自天然来源，如具有高糖含量的样品，如蜂蜜，蜜饯和花粉。根据其将葡萄糖转变为赤藓糖醇的能力及其不同的形态学和生理学性状鉴定各菌株。本专利技术的酵母菌株能将1g葡萄糖转变为至少0.3g赤藓糖醇(即转化率≥30％)。30℃，在50ml烧瓶中，在含有30％葡萄糖和1％酵母浸膏的10ml肉汤中旋转振荡培养菌株6天(最初的细胞密度为1×105个细胞/ml)来测定转化率。20℃，在4％麦芽提取物/0.5％酵母浸膏琼脂中生长10天之后测定形态学性状。参见酵母，分类学研究，Kurtzman等编，第4版，p785，Elsevier，阿姆斯特丹(1998)。另一方面，通过下文实施例中所述的方法测定生理学性状。本专利技术的其它酵母菌株可以是衍生自分离于天然来源之菌株的变异体。例如，这些菌株可以是通过UV照射，N-甲基-N′-亚硝基胍处理，甲磺酸乙酯处理，亚硝酸处理，丫啶处理等得到的突变体。它们也可以是利用细胞融合或重组DNA技术经基因工程改造产生的重组菌株。根据下列仅为了阐明而不是限制其公开内容的具体实施例，本领域技术人员可得到并最大程度地利用本专利技术的酵母菌株。本文提及的所有出版物都列入本文作为参考。使用Hewlett Packard H4033A分析仪，在Ion-300层析柱上将温度设置为75℃，以0.1N硫酸作为流动相，以0.4ml/分钟的流速进行HPLC分析。根据Neissner等的方法(Neissner等，1980，赤藓糖醇脂肪酸酯的制造、分析和DC-分离，FETTE’SEIFEN’ANSTRICHMITTEL.8210-16)进行TLC分析。用4％硼酸冲洗Kieselgel 60F254(Merck)之后，使用前还应将凝胶置于105℃的温箱中加热20分钟。扩散溶剂是乙基甲酮∶丙酮∶水(体积比为100∶10∶10)，生色剂是溶于浓硫酸中的KMnO4。通过萃取进一步纯化经HPLC或TLC纯化自上清液中的赤藓糖醇，然后进行减压干燥。根据Shindou等的方法(Shindou等，1989，通过HPLC和GC-MS鉴定多种果肉中的赤藓糖醇并进行定量测定，农业食品化学杂志，371474-1476)将经进一步纯化的产物和赤藓糖醇标准进行乙酰化。通过GC-MS检测所得样品以测定经再次纯化的产物是否与标准样品相同。从370个样品中共分离出630株菌，其中22株显示出生产赤藓糖醇的能力。从经加工的蜂蜜、经加工的花粉和糖蜜中得到161株分离物，从中选出6株赤藓糖醇生产菌，其赤藓糖醇转化率为0.5至1.5％。低转化率可能是生产赤藓糖醇的微生物消失所致，因为在采集样品之前，己将其加热和干燥。发现分离自49个蜂蜜样品(大多数未经加工)的26株菌中有3株，即440，441和442可以高转化率(＞30％)地由葡萄糖生产赤藓糖醇。分离自糖厂废水和泥样品的66株菌中无一显示出生产赤藓糖醇的能力。从粗花粉和蜜饯样品中分离出3个优良的赤藓糖醇生产菌株(转化率＞30％)，即166-2，262-1和278-3。为了研究葡萄糖浓度对赤藓糖醇生产的影响，于30℃，分别在含有1％酵母浸膏和20％、30％和40％葡萄糖的培养基中以150rpm的转速摇瓶培养菌株166-2，262-1和278-3达1至6天(50ml烧瓶，10ml培养基；最初的细胞密度为1×105个细胞/ml)。然后测定所产生的赤藓糖醇的量。结果表明在30％葡萄糖培养基中培养6天的3株菌(测定本专利技术酵母菌株转化率的标准方法)皆显示出超过30％的转化率。另外，在含有40％葡萄糖的培养基中培养6天后，所有3株菌的转化率皆约为30％。至于葡萄糖的消耗，在含有30％葡萄糖的培养基中培养时，菌株166-2在第5天消耗掉了所有的葡萄糖，菌株262-1和278-3在第6天消耗掉了所有的葡萄糖。在30％葡萄糖培养基中分别加入0.5、1.0和1.5M的KCl或NaCl所进行的研究表明离子渗透压的增加使所有3株菌的转化率降低。pH分布图的研究表明在pH4.0-7.0，在30％葡萄糖培养基中生长的3株菌的转化率大致相同。pH8时转化率降低。分别于25℃、30℃和35℃在30％培养基中培养菌株166-2、262-1和278-3。所有3株菌在30℃时显示出最高的转化率，在25℃时显示出最低的转化率。还研究了不同培养基对赤藓糖醇生产的影响。当30％葡萄糖被30％麦芽糖替代时，所有3株菌都不产生赤藓糖醇。用30％麦芽本文档来自技高网...

【技术保护点】
能在含有３０％葡萄糖和１％酵母浸膏的培养基中将葡萄糖转变为赤藓糖醇的酵母菌株，所述菌株的特征在于缺乏能动孢子；具有有隔菌丝体；无性繁殖；缺乏肾形细胞；分生孢子任选在短的小齿而不是长柄上形成；缺乏掷分生孢子；在宽基上非－单极出芽；顶生的芽分生孢子链；深棕色，厚壁的厚壁孢子；有发酵能力；有同化蔗糖、甘油和麦芽糖的能力；不能同化乳糖；不能发酵半乳糖；能在２５℃－３６℃生长。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林锡杰，温秋燕，许文浩，刘桂郁，朱文深，
申请(专利权)人：食品工业发展研究所，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]