一种用于增强乙肝疫苗免疫效应的佐剂及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于增强乙肝核酸疫苗免疫效应的佐剂及制备方法。该佐剂为含有胸腺素α１（ＴＡ１）和干扰素α８（ＩＦＮα８）融合基因片段载体的制剂，所述载体是通过将胸腺素α１和干扰素α８融合基因片段连接到各种非复制型哺乳动物细胞高效表达载体中，大量扩增纯化后获得的。该佐剂与Ｓ↓［２］Ｓ核酸疫苗联合接种ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后，能增强Ｓ↓［２］Ｓ核酸疫苗的体液免疫应答；单独接种乙肝病毒转基因小鼠Ｃ↓［５７］ＢＬ／６小鼠，能够明显抑制小鼠ＨＢＶ　　ＤＮＡ的复制和表达。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于增强乙肝核酸疫苗免疫效应的佐剂及制备方法。
技术介绍
乙型病毒性肝炎(Viral hepatitis B)是目前危害我国人民身体健康最为严重的感染性疾病。据调查，我国慢性乙肝病毒感染者多达1.2亿以上，其中慢性乙肝患者达2000万以上。携带者及慢性肝炎患者中部分病例可发展为重症肝炎、肝硬化甚至肝癌，每年死于肝炎及其相关性疾病的患者不下30万例。据估算，每年因为肝炎及其相关性疾病导致的经济支出高达300-500亿元。乙肝病毒感染至今尚无特效治疗方法。目前临床上应用的慢性乙肝治疗药物均存在疗效不尽如人意、副作用多等多方面的缺陷，远不能满足乙肝病毒感染防治的需要，这给乙肝的防治带来了巨大困难。因此，开发高效的抗乙肝病毒药物，具有迫切的临床需要。核酸疫苗及治疗性核酸疫苗是国际上20世纪90年代以后发展起来的新兴生物技术，在预防和治疗慢性乙肝病毒感染方面具有广阔的发展前景。乙肝治疗性核酸疫苗与传统药物相比具有以下优越性(1)传统药物仅能可逆性地降低HBV DNA复制水平，部分清除HBeAg，而对清除HBsAg基本无效；从理论上讲，治疗性核酸疫苗可望发展为HBV感染的根治药物，不但能清除HBV基因表达产物(HBsAg、HBeAg)，而且可以大幅度降低或清除HBV DNA，使治疗更为完全、彻底。(2)Davis、Hui等通过转基因小鼠动物模型研究发现，治疗性核酸疫苗应用过程中不会导致肝功能指标的升高，不引起肝脏病理损害，这一特点也明显优越于现有的抗病毒药物。(3)乙肝治疗性核酸疫苗表达载体为质粒载体，无病毒性载体的安全性顾虑，疫苗接种方法简单、易行，可重复注射，目的基因表达持续时间不长，但足以介导良好的免疫应答，且目的基因不需要精确调控。(4)由于治疗对象均为HBV感染者，且目的基因片段并不含有完整的病毒颗粒，在机体染色体DNA上随机整合率低、应用较为安全。目前乙肝核酸疫苗研发中遇到的主要问题是免疫效果还不能满足临床需要，国内外相关机构正在进行多方面的改进和完善，有关研究主要集中在以下方面1.目的基因片段的选择多项研究显示，HBV S基因为诱导HBsAg特异性CTL活性所必需，而preS1或preS2基因的加入可增强机体的免疫应答。Davis等在HBV基因疫苗诱导CTL活性的研究中发现，基因疫苗可十分有效地诱导HBV特异性CTL应答，从而为开发新型乙肝治疗性核酸疫苗提供了强有力的理论依据。Davis等在随后的研究中采用包含HBV DNA S及preS2基因的质粒pCMV-S2S免疫HBsAg转基因小鼠，观察到部分小鼠早在DNA疫苗注射后2周，血清HBsAg即消失，不经加强注射持续至12周以上，而另外一些小鼠，HBsAg水平明显下降且维持在较低水平。同时，血清中抗HBs产生。所有小鼠均未见肝脏出现明显的坏死及炎症病理变化。Hui等构建了包含HBV S基因及preS121-47位多肽编码基因的重组质粒pCMV-SS1，用于免疫HBsAg转基因小鼠，结果发现pCMV-SS1给药导致80％的转基因小鼠循环中HBsAg的清除或水平明显下降(下降至用药前的1/1000水平)，明显高于pCMV-S(40％)，而空载质粒无效，非空载质粒给药组均观察到较高的抗HBs水平，而pCMV-SS1质粒组还观察到抗preS1的产生。这亦为核酸疫苗清除慢性乙肝病毒感染提供了强有力的实验依据。采用HBe/cAg抗原编码基因片段构建核酸疫苗的研究亦见诸报道，但Matti等的研究表明，包含HBe/cAg基因的表达质粒并无清除HBV慢性感染大猩猩体内病毒的作用。目前国内外已经采用的乙肝核酸疫苗基因片段及组合方式主要有S基因、S+preS121-47位多肽编码基因、preS2S、C、SC、preS1preS2S等基因片段，相关专利如下 表1 乙肝核酸疫苗基因片段选择相关专利专利号申请日期专利技术人 基因片段 载体1 US05024938 1991.07.18 Nozaki，et al.(SC)3PSHB32 US06025341 2000.02.15 Jack R，et al.S1/S2/S+HCV corepcDNA33 WO00016802 2000.03.20 Shan LU，et alC(35nts deleted) PJW43034 CN1108306 1995.09.13李光地 SS1V.V5 CN175585A 1998.03.13李光地 C(AA1-144)(AA1-44/69) pcDNA36 CN1209340A 1999.03.03饶伟华 S1/S2/S7 CN1316518A 2000.06.19陈光明 S2S+GM-CSF/IL-2 IFN-γ pcDNA3.18 CN1324661A 2001.05.23孙树汉 S2S+CpG pVAX2.表达载体的选择和载体构建方法核酸疫苗常以高效哺乳动物细胞表达质粒为载体或采用逆转录病毒载体。质粒载体必须是能在大肠杆菌中高拷贝扩增，哺乳动物细胞内高效表达，而不能复制，同时也不含有在宿主细胞基因中整合的序列。目前常用于构建核酸疫苗的表达质粒主要包括(1)pcDNA3Invitrogen公司开发的商品化质粒载体，是常用的克隆与表达目的基因载体，含CMV立即早期启动子、多克隆位点及牛生长激素多聚腺苷酸信号序列，采用新霉素抗性基因进行抗性筛选。(2)pVAX1Invitrogen公司开发的商品化质粒载体，为FDA批准唯一用于核酸疫苗的表达载体，含CMV和T7启动子、BGH多腺苷酸信号尾和Kan抗性基因。(2)pRC/CMVClontech公司开发的商品化质粒载体，广泛用于研究，含CMV立即早期启动子，外源基因有较高的表达效率，注射后可产生较高的体液免疫及细胞免疫应答。(3)pCIPromega公司开发的商品化质粒载体，含CMV立即早期启动子、多克隆位点、SV40晚期多聚腺苷酸信号序列及能够提高目的基因表达水平的嵌合型内含子。载体的选择和构建方法对于提高核酸疫苗的免疫效应至关重要。其影响因素主要包括(1)目的基因片段的优化和连接方法核酸疫苗本身不带目的基因的蛋白合成系统，完全依赖于宿主细胞调控。将外源基因优化为宿主细胞偏好的密码子，可改善目的蛋白的合成，从而增强免疫效果。对于多个片段组成的共表达形式，各个片段之间的连接方式亦非常重要。目前大多数学者主张采用Gly4Ser1编码基因的2-4次重复序列作为不同基因片段之间的连接序列，以利于蛋白质更好地表达及生物学活性的稳定。此外，目的基因转录翻译起始区应含有核糖体结合位点，以提高基因转录和蛋白质的表达效率。(2)外源基因转录启动子/增强子序列一类是致病性的病毒启动子，在多数哺乳动物细胞中具有较高水平的转录起始能力，目前认为hCMV启动子较SV40及MPSV启动子能更好地发挥作用。另一类是哺乳动物启动子，适合在人体或动物中使用，如来自哺乳动物的MHC I启动子/增强子BL3-60prmtr(Harms JS，et al.Braz J Med Biol Res1999，32155-62)，人肌肉特异性肌酸激酶启动子(Baztlett e本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于增强乙肝疫苗免疫效应的佐剂，其特征在于该佐剂为含有胸腺素α１和干扰素α８融合基因片段载体的制剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守春，周陶友，刘忠荣，李伯刚，闫娟，陈毅荣，
申请(专利权)人：成都地奥集团药物研究所，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]