具有佐剂作用的细菌膜组分制造技术

本发明专利技术涉及革兰氏阴性菌尤其是肺炎克氏杆菌的膜组分联合抗原或半抗原在制备设计用于将免疫应答引向对抗所述抗原或半抗原的Ｔｈ１和／或混合的Ｔｈ１／Ｔｈ２型应答的药物组合物中的用途。本发明专利技术还涉及制备所述膜组分和含有它们的药物组合物的方法，以及它们在预防和治疗感染性疾病，尤其是那些涉及副粘病毒例如ＶＲＳ的感染性疾病和癌症，尤其是那些带有肿瘤相关抗原的癌症中的用途。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及革兰氏阴性细菌尤其是肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)的膜组分联合抗原或半抗原，在制备旨在将免疫应答引向Th1型和/或混合的Th1/Th2型应答的药物组合物中的用途，其中所述免疫应答对抗所述抗原或半抗原。此外，本专利技术包括用于制备所述膜组分和含有所述膜组分的药物组合物的方法，以及它们在预防和治疗感染性疾病(尤其是RSV等副粘病毒造成的感染)和癌症(尤其是那些其肿瘤与肿瘤抗原相关的癌症)中的用途。接种疫苗是一种预防或降低尤其是感染的有效手段。接种运动在该领域的成功使疫苗的概念可以延伸到自身免疫病、癌症和生殖领域。另一方面，单独接种抗原并不总是能够引起快速而持久的抗体应答，这就需要佐剂，即帮助(来自拉丁文adjuvare帮助)这些抗原诱导该应答的化合物的存在。佐剂构成一组结构和来源均不同的化合物。因此，在该范畴中有尤其是油包水型(弗氏不完全佐剂)或水包油型乳剂、细菌来源的化合物例如来自革兰氏阴性细菌的脂多糖衍生物、和铝盐。目前，仅铝盐被作为佐剂在疫苗制品中应用于人。对抗抗原的抗体应答的发生需要一系列的复杂事件。它涉及呈递该抗原的细胞、调节性T淋巴细胞(Th，即T“辅助细胞”)、和产生抗体的B淋巴细胞。两种类型的Th淋巴细胞可以根据它们产生的细胞因子类型来区分1型Th淋巴细胞在小鼠中产生IFN-γ和IL-2，并促进IgG2a的形成，而2型Th淋巴细胞在小鼠中产生II-4、IL-5和IL-10，并引起IgG1的形成(Mosman，T.R.和Sad S.当代免疫学(Immunol.Today)1996，17138)。而且，已经显示，对于相同的给定抗原，正是佐剂在抗体应答期间造成了占优势的同种型(Toellner K.-M.等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1998，1871193)。因此，已知铝盐例如铝胶在小鼠中诱导基本上是Th2型的应答，并促进IgGl或甚至是IgE的形成(Allison A.C.疫苗设计-细胞因子网络的角色(Vaccine design-The role of cytokine networks)第293卷，1-9，Plenum Press，1997)，这会给有过敏性体质的患者造成问题。而且，根据所设想的治疗目标，可能期望Th1或混合(Th1/Th2)型应答。因此，目前需要获得能够诱导Th1或混合(Th1/Th2)型免疫应答，优选其中Th1应答接近或高于Th2应答的混合Th1/Th2型应答的新佐剂。令人惊奇的是，本专利技术的作者阐明了革兰氏阴性细菌肺炎克氏杆菌的膜组分(又称FMKp)，尤其是按以下实例中所描述的方法获得的膜组分的特殊性质。事实上，作者发现，所述膜组分FMKp联合抗原不仅能够增强对抗所述抗原的抗体应答，而且能够将细胞因子应答重新引向Th1/Th2型分布，因此与所寻求的特殊佐剂活性相符，而且这与所述膜组分的施用方式并不相关。因此，本专利技术的主题是革兰氏阴性细菌尤其是肺炎克氏杆菌的膜组分联合抗原或半抗原，在将免疫应答引向对抗所述抗原或半抗原的Th1型和/或混合的Th1/Th2型应答中的用途，或在制备旨在将免疫应答引向对抗所述抗原或半抗原的Th1型和/或混合的Th1/Th2型应答的药物组合物中的用途。关于将免疫应答引向Th1和/或混合Th1/Th2型应答的问题，优选尤其是相对于用明矾佐剂获得的Th1/Th2应答而言引向促进诱导Th1应答的免疫应答。关于将免疫应答引向Th1和/或混合Th1/Th2型应答的问题，尤其更优选引向对抗相关抗原的IgG2a抗体的效价相对于用明矾佐剂获得的IgG2a效价增加了至少10倍、优选至少25倍、50倍和100倍的免疫应答。以一种尤其优选的方式，该免疫应答被引向其中Th1应答接近或高于Th2应答的Th1和/或混合Th1/Th2型应答。词语“接近”应理解为是指，当以对抗相关抗原的IgG2a抗体的效价表示时，应答是对抗所述抗原的IgG1抗体效价的至少0.5倍，优选至少0.75倍，而且对抗该相关抗原的IgG抗体效价接近或高于用明矾或弗氏佐剂获得的对抗该相关抗原的IgG抗体效价。本专利技术还涉及根据本专利技术的用途，其特征在于该膜组分含有至少两种不同细菌菌株的膜组分。词语细菌的膜组分在本专利技术中应理解为是指从所述细菌的培养物获得的并且其制备方法至少包含了如下步骤的任何纯化或部分纯化的膜组分或提取物，该步骤是裂解培养后获得的该细菌，并通过尤其是离心或过滤，从该裂解步骤后获得的总裂解物中分离含有所述细菌的膜的组分。在本专利技术中，当所述细菌是肺炎克氏杆菌时，词语“细菌膜组分”还应理解为是指具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的P40蛋白，即肺炎克氏杆菌膜组分中的一种活性组分，或其片段之一。根据本专利技术，这些膜组分可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如Haeuw J.F等(欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)255，446-454，1998)所描述的方法。根据一个具体实施方案中，本专利技术涉及根据本专利技术的用途，其特征在于该膜组分是通过包含以下步骤的方法制备的a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，之后离心所述培养物；b)如果适当的话，失活步骤a)获得的细菌沉淀中的分解酶，之后离心获得的悬浮物；c)通过在抽提溶液中对步骤a)或b)中获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤，从该沉淀中抽提和除去非膜蛋白质和核酸；d)在存在蛋白水解酶的情况下消化步骤c)中获得的膜沉淀，之后离心；e)在生理盐水和/或蒸馏水中对步骤d)中获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤；和f)超声处理步骤e)中获得的沉淀。步骤b)，对步骤a)获得的细菌沉淀中的分解酶的失活，可以通过任何已知的酶失活方法来实现，例如尤其是通过将该重新悬浮的细菌沉淀加热至优选近100℃的温度，或通过加入这些酶的活性的抑制剂来实现。步骤c)，从步骤a)或b)获得的沉淀中抽提并除去非膜蛋白质和核酸，可以通过例如在抽提溶液中对该沉淀进行至少一个如下循环的洗涤来实现，即加入高渗溶液(抽提溶液)，优选摩尔浓度接近1M的盐溶液，在足以达到期望效果的接触期之后，离心获得的悬浮物，并除去在所述离心后获得的上清液，可以重复几次该洗涤循环。步骤d)，消化步骤c)中获得的膜沉淀，可以在存在蛋白水解酶例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或任何已知的具有蛋白水解活性的酶的溶液时进行，其中反应条件、溶液的pH、反应温度和持续时间均优选调节至对于所选酶而言最佳的条件，并在反应后进行离心，该消化循环可以采用相同的酶、相同的酶组合、或针对进行的每个消化循环而言采用不同的酶重复几次。步骤e)，洗涤步骤d)中获得的沉淀，是通过将该沉淀放入生理盐水或蒸馏水中，在足够的接触期后进行离心来实现的，可以将该洗涤循环重复几次。最后步骤f)，沉淀的超声处理，旨在尤其是分解和匀浆步骤e)结束时获得的膜组分。该超声条件(持续时间和强度)将由本领域技术人员，根据例如待处理的膜组分的量来确定。根据另一个具体实施方案，本专利技术涉及根据本专利技术的用途，其特征在于该膜组分是通过包含以下步骤的方法制备的a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，之后，如果适当的话，进行离心；b)冷冻步骤a)获得的该培养基或沉淀，之后融化并干燥细胞；c)利用DNase本文档来自技高网...

【技术保护点】
肺炎克氏杆菌膜组分联合抗原或半抗原在制备旨在将免疫应答引向对抗所述抗原或半抗原的Ｔｈ１型和／或混合Ｔｈ１／Ｔｈ２型应答的药物组合物中的用途。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：C里博，N科瓦雅，TN恩格耶，A贝克，JY博奈弗伊，
申请(专利权)人：皮埃尔法博赫药品公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]