一种用于重组表达人干细胞因子的原核表达载体，其特征在于，所述的载体含有人干细胞因子表达盒以及与所述表达盒操作性相连的启动子，所述的表达盒从５’至３’依次具有：序列为ＴＴＡＡＣＴＴＴＡ的增强子、长度为１４±２ｂｐ的上游间隔序列、和人干细胞因子的编码序列、终止密码子。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域。更具体地，本专利技术涉及一种新的表达人干细胞因子的原核表达载体及工程菌，该工程菌高密度发酵方法以及从该工程菌中提取制备高活性重组人干细胞因子的方法。
技术介绍
干细胞因子(stem cell factor，SCF)，又称为肥大细胞生长因子(MGF)，c-kit配体及Steel因子，为c-kit原癌基因编码的受体的配体蛋白。SCF主要由基质细胞产生，是一类刺激早期造血干细胞及祖细胞增殖和定居的造血生长因子，SCF在造血干细胞的发育、黑色素生成以及生殖细胞发育中发挥着重要作用。它参与机体发育过程中的多种细胞生长的调控，是造血干细胞增殖分化的关键因子。SCF与其它细胞因子(如GM-CSF、IL-3)合用时，能刺激来源于骨髓、外周血、脐带血中的造血干细胞的增殖。因此SCF在造血干细胞移植、肿瘤放疗、化疗导致的骨髓功能衰竭等的造血功能恢复治疗、再生障碍性贫血及其它血液病的治疗方面有着很广阔的应用前景。编码人SCF基因位于第12号染色体(12q22-24)，全长50kb左右。人SCF基因含有8个外显子，经克隆后编码人SCF的cDNA序列全长为543kb。由于编码基因剪切位点不同，可翻译成两种蛋白，表现为可溶性SCF(sSCF)和膜结合型SCF(mSCF)。这两种SCF的形成与mRNA的不同拼接方式有关，前者包含外显子6编码的氨基酸残基序列，编码的蛋白质有248个氨基酸，以SCF248表示，由于该分子含有跨膜区及由第6外显子编码的一个蛋白酶切割位点，酶切后的产物能以可溶性分子的形式可被分泌到细胞外。另一种编码产物含220个氨基酸残基，有跨膜区，但在由第6外显子编码的序列中缺乏相应的蛋白切割位点，翻译后的蛋白质以膜蛋白形式存在于细胞膜表面发挥相应的生物学活性，因而这种SCF为膜结合型，以SCF220表示。可溶性和膜结合型的SCF都有生物学活性。由于天然SCF来源有限，难以大规模生产，不能满足日益增长的临床前研究及临床研究的需要。通过将人SCF膜外活性部分的165个氨基酸的cDNA克隆入表达载体，在大肠杆菌中表达出的SCF就有天然生物学活性，其分子量约为18kD，在溶液中通常以非共价键相连的二聚体形式存在。由于骨髓基质细胞和胸腺组织富含SCF mRNA，可通过逆转录PCR的方法扩增出人SCF基因，但由于组织细胞中的SCF mRNA较少，可通过多次PCR从组织细胞中扩增SCFmRNA；也可以直接从真核细胞基因文库筛选出SCF基因。可用于表达SCF的原核表达载体很多，但表达量一般占总蛋白的10％左右(Martin，FH，1990，Cell，63(2)203-211；Langley，KE，1992，Arch Biochem Biophy，295(1)21-28)，很少有高效表达SCF的载体。国内有进行密码子突变来进行高效表达，见中国公开专利号CN1314470A(申请号01109409.5)。研究发现，外源基因上游的一个SD序列在很多情况下不足以提供高水平表达。T7噬菌体的基因10(gene 10 of the phage T7)编码噬菌体外壳蛋白，该蛋白是T7噬菌体感染大肠肝菌以后的主要表达产物。该基因上游由9个核苷酸组成的序列“TTAACTTTA”是一个非常高效的核糖体位点(RBS)，通过与核糖体结合而启动下游基因的翻译，其效率超过一般的大肠杆菌RBS(即SD序列)数十倍，因而被称为“翻译增强子”。因此，在通常的原核表达质粒中引入该序列可能提高外源基因表达(Lehmeier B et al，1992，J of Biotechnol，23(2)153-165；Olins PO et al，1988，Gene，73(1)227-235)。然而，当在外源基因的上游仅有翻译增强子时，有时其表达量仍难以令人满意。因此，本领域迫切需要开发新的高效表达干细胞因子的方法、表达载体和宿主细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种高效表达人干细胞因子的方法、表达载体和宿主细胞。在本专利技术的第一方面，提供了一种用于重组表达人干细胞因子的原核表达载体，所述的载体含有人干细胞因子表达盒以及与所述表达盒操作性相连的启动子，所述的表达盒从5’至3’依次具有序列为TTAACTTTA的增强子、长度为14±2bp的上游间隔序列、和人干细胞因子的编码序列、终止密码子。在另一优选例中，所述的表达载体为pBV220，且所述的上游间隔序列为SEQID NO7中第10-23位，即TAAAGGAGGAATTC。在另一优选例中，所述的人干细胞因子的编码序列编码人干细胞因子第1-165位的氨基酸序列。在本专利技术的第二方面，提供了一种大肠杆菌，它含有本专利技术上述的原核表达载体。在另一优选例中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌DH5α菌株。在本专利技术的第三方面，提供了一种制备重组人干细胞因子的方法，包括步骤(a)培养本专利技术上述的大肠杆菌，至OD600值为30-45；(b)诱导培养步骤(a)的大肠杆菌，从而表达重组人干细胞因子；(c)分离出表达的重组人干细胞因子。在另一优选例中，在步骤(a)中使用的初始培养基含有0.1-1mM浓度的微量元素、1-5％的葡萄糖、1-5％甘油和1-5％酵母浸出物，并且在培养过程中补充的养料为10-40％浓度的葡萄糖，5-10％酵母浸出物和5-10％蛋白胨。在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(d)对包涵体变性、复性、酸沉淀、阳离子交换、和反相柱层析，从而得到纯化的重组人干细胞因子。在另一优选例中，所述的复性的复性时间为24-60小时，最佳复性时间为48±2小时，复性的蛋白浓度为200-500ug/ml，最佳的蛋白浓度为300±10ug/ml。在另一优选例中，所述的酸沉淀条件是蛋白的浓度为0.5-2mg/ml，最佳的蛋白浓度为1.2±0.1mg/ml，所用的酸为10％的冰醋酸(V/V)，沉淀时的pH为4.0-5.0，以4.5为最佳。在另一优选例中，所述的阳离子交换层析条件是pH为4.0-4.5，最佳为4.5，所采用的阳离子交换剂固定在载体底物上的磺基，优选的凝胶介质为Source30S(Amersham Phamarcia公司)。在另一优选例中，反相柱层析的条件是填料为Source15RPC(AmershamPhamarcia)，洗脱剂为12.5mM HCl的80％乙醇溶液。附图说明图1显示了不同培养基对DH5α/pBV220-rhSCF原核表达工程菌SCF表达量的影响。其中，泳道1标准分子量；泳道22YT；泳道3M9；泳道4M9plus+2YT；泳道5LB；泳道6SOB；泳道7SOC。结果表明，在2YT和M9plus+2YT中，分子量约18kD的rhSCF蛋白表达明显高于其它培养基。图2显示了原核表达工程菌DH5α/pBV220-rhSCF发酵生长曲线。经优化的SCF发酵方法，工程菌在发酵8-18小时内，基本以稳定的速率(约0.15OD600/小时)增长，至发酵结束时细菌OD600可达约40。图3显示了不同复性时间后SDS-PAGE分析rhSCF的复性效果。其中，泳道1标准分子量；泳道2复性5小时后还原型电泳；泳道3复性5小时后氧化型电泳；泳道4未复性样品还原型电泳；泳道5未复性样品氧化型电泳；泳道6复性48小时后还原型电泳；本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈国友，蒋应明，黄欣，张意，卢琳，施群英，曹雪涛，
申请(专利权)人：第二军医大学免疫学研究所，
类型：发明
国别省市：
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