一种抗菌活性更高的改良鲎素的基因，其特征在于，它包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的核苷酸序列。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
鲎是海洋里的一种节肢动物，被称为动物界具有独特进化地位的“活化石”，在其神奇的蓝色血液中含有多种生物活性肽，其中就包括一类抗菌多肽一鲎素。自1988年Nakamura T.、Furunaka H.等在鲎的血细胞中找到第一种鲎素，迄今为止已发现了5种，它们组成鲎素家族(Nakamura T.J Biol Chem 1988，26316709-13；Miyata T.J Biochem 1989，106663-8)。这类抗菌多肽氨基酸序列较为保守，抗菌谱广，不仅可以抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，对真菌生长一样有抑制作用，而且近年来发现其对肿瘤和HIV等也具有一定的作用效果，故日益被研究者所关注。天然鲎素是有17-18个氨基酸的阳离子多肽，本身带有6-7个碱性氨基酸，其氨基端和羧基端都是碱性氨基酸，羧基端还具有一个独特的精氨酸-酰胺结构。四个Cys形成二个二硫键维持鲎素折叠成发夹结构。五种鲎素的大部分氨基酸替代发生在Arg和Lys之间，其一级结构如下(MutaT.J Biochem，108261-6) 鲎素的前体有77个氨基酸残基，经体内蛋白酶和酰胺化酶作用后，再与其他物质结合形成血细胞的小颗粒。虽然大多数抗菌蛋白C末端都有酰胺化氨基酸，但在鲎素中酰胺化对其抗菌活性并无决定作用，许多化学合成的人工鲎素及其类似物未对C端的Arg酰胺化，但活性并无影响(Oishi O.Peptide Res，1991，495-101；Shieh T.C.，FBES Lett，1989，252121-124)。实际上其他的一些抗菌蛋白如Nisin，酰胺基对其抗菌活性也是可有可无，可能酰胺化维持多肽在体内的稳定，免于被羧基蛋白酶降解。另外早期的研究认为鲎素的二硫键对抗菌活性很重要，因为它维持着β-折叠(Tamamura H.，Chem Pharm Bull 1993，41978-80；Park N.G.，Biochemistry，1992，3112241-7)。但后来发现这些结论比较片面，当用甲基乙酰氨基团修饰或用Ala、Asp替代Cys，的确会引起线形多肽形成无规则卷曲，从而导致活性的降低，但用其他氨基酸替代Cys时情况则不同，抗菌活性变化不大甚至可能比原多肽还高，如芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸，特别是用Tyr替代时结构上最接近天然状态(Tam J.P.，BiochemBiophys Res Commun 2000，267783-90；Matsuzaki K.，Biochemistry，1997，369799-806)。但二硫键除了稳定结构外，可能还有其他作用。鲎素是带正电荷的两亲性多肽，其结构由二硫键形成环状的反平行β-折叠。Ohta等发现Tachyplesin I能在40分钟内不可逆地抑制细菌的生长。抗多粘菌素的细菌仍然对鲎素敏感，这说明鲎素更易于作用外膜结构而不仅仅是脂多糖。在体外实验中，发现鲎素先是通过Trp等与双层脂膜平行结合，此过程中对膜结构的影响不大。然后一部分多肽相互集结，在膜上形成了大小不一的阴离子选择通道。离子通道的形成破坏了膜电位，造成细胞内外的物质相互渗漏。但这种通道并不永久维持，逐渐地这些通道会消失，因为抗菌蛋白会转移到膜的另一面，并与之平行结合(Matsuzaki K.Biochim Biophys Acta，1999，14621-10)。实际上许多种类的抗菌蛋白，无论是α-螺旋，还是β-折叠结构上都具有二个特点带正电荷和双亲性，而且都会在脂膜上形成离子通道，只不过是形成的过程和方式有所差别(Matsuzaki K.Yakugaku Zasshi，1997，117253-64；Ohta M.Antimicrob Agents Chemother，1992，361460-5；Lear J.D.Science，1988，2401177-81)。在鲎体内发现鲎素不仅直接地还可通过另一种方式间接地参与抗菌活性。在昆虫和甲壳动物中，酚氧化酶激活系统是宿主重要的防御病虫害系统，特别是在感染初期，细菌细胞壁的脂多糖、肽聚糖、葡聚糖可引发酚氧化酶激活系统的一连串级联放大反应。血蓝蛋白本身与甲壳素并无亲和性，但鲎素包裹了甲壳素后，可与之结合，然后血蓝蛋白被诱导转变成为酚氧化酶，经过各种反应后，促进了外骨骼的伤愈。实验发现，如果对鲎素的Trp和Tyr化学修饰，多肽与血蓝蛋白的亲和力急剧下降，说明他们的结合位点处于鲎素的疏水区域(Nagai T.J Biol Chem，2001，27627166-70)。鲎素也是一类抗脂多糖结合因子，相对磷脂，鲎素与LPS的亲和力提高了280倍。LPS可诱导C因子活化，从而促进凝血过程，还可引起过敏反应，造成败血脓肿等甚至死亡。利用鲎素可特异性阻止LPS介导的凝血过程，减轻临床病症(Hirakura Y.Biochim Biophys Acta，2002，156232-6)。早在1992年人们就利用DNase I保护，硫酸二甲脂法等脚印技术发现鲎素的反平行β-折叠结构能与DNA的小沟结合，如果用二硫苏糖醇处理或Ala替代Cys，影响β-折叠，则这种与DNA的结合能力就会丧失。这说明鲎素在体内可能会影响转录和翻译，从而影响细菌、细胞的生理活动。而后不断有实验证明鲎素促进细胞分化，抑制肿瘤细胞的生长(LiQ.F.World J Gastroenterol，2003，9454-8)。鲎素结构简单，分子量小，可在其氨基酸序列的基础上进行不同的增加、删减，替代和修饰得到新的多肽，然后对比它们之间结构和生物活性的不同。在研究鲎素抗病毒活性时发现，Trp对抑制病毒复制很重要，替代它后，活性明显丧失，从氨基端起第一个Tyr也很重要，它能提供能量到Trp。有人在polyphemusin I的Gly11和Phe12之间插入一个Arg，增加多肽的正电荷的同时也使环结构变大；为了使β-折叠两端的电荷和疏水性更加明显，把Tyr-Arg换成Arg-Tyr，这些改变对抗菌活性影响不大，但略有降低(Zhang L.Biochemistry，2000，3914504-14)。在Cys的替代上发现，Ala和Asp会使抗菌活性下降很多，甚至失活。但芳香族氨基酸Phe、Tyr和脂肪族氨基酸Leu的取代抗菌活性不仅没丧失，对有些菌株还有所提高，特别是Tyr作用明显。有研究表明在设计抗菌蛋白的过程中，用Lys代替Arg时，会引起对某些菌株抗性的降低，如抗大肠杆菌、沙门氏菌等，并且在高盐环境下，这种活性的丧失可能会更严重。Arg看起来比Lys更适合用于设计β-折叠的小多肽，因为它能增强抗大肠杆菌的活性，并且在高盐环境下维持稳定(Muhle S A.Biochemistry，2001，405777-85)。Tam J.P.等在Tachyplesin I的基础上设计了头尾相连在一起的18个氨基酸的环形多肽，内部有三个二硫键，它与Tachyplesin I相比对人红血球更无毒性。而且在高盐环境下，生物活性比低盐环境还高(Tam J.P.Biochem Biophys Res Commun，2000，267783-90)。Tamamura H等人根据polyphemusin II人工合成了T22(本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，范云六，史秀云，王亚茹，袁铁铮，徐锋，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：
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