从酱油、豆奶、番茄酱中分离残留DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种从酱油、豆奶、番茄酱中分离残留ＤＮＡ的方法。方法的步骤为：取适量的酱油、豆奶或番茄酱，离心后弃上清，保留沉淀；取ＣＴＡＢ提取缓冲液溶解沉淀；保温，其间不时轻缓颠倒混匀；加入等体积的苯酚／氯仿，混匀至乳浊状；离心至分相；吸上清用Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ５０柱离心过柱；加入等体积的异丙醇；离心弃上清，保留沉淀；乙醇洗涤，离心，重复洗涤；室温干燥后，向沉淀中加入Ｃｈｅｌｅｘ溶液混匀，煮沸离心，其上清可直接用于聚合酶链式反应的模板。应用本发明专利技术公开的技术流程所分离的酱油、豆奶、番茄酱残留ＤＮＡ，适用于转基因农产品的多聚酶链式反应检验及相关领域。该方法简单且有效、成本低，所获得的痕迹量ＤＮＡ可用于定性和定量ＰＣＲ扩增，且灵敏度和检出率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术为生物
，尤其涉及一种从酱油、豆奶、番茄酱中分离DNA的方法。
技术介绍
自1983年世界上第1株转基因植物诞生以来，以转基因技术为核心的现代生物技术迅猛发展。以转基因生物为直接食品或原料加工生产的食品即为转基因食品。目前大部分转基因食品来源于转基因农作物，其对人类的贡献很大，可以改善食品的品质、抗病虫害、增产及减少农药使用量，从而带来显著的经济效益和社会效益。在回归自然，提倡有机食品的今天，消费者对转基因食品的安全性仍心存疑虑，转基因作物和食品所带来的争论是人们始料不及。争论的焦点一是转基因食品对人体健康的直接或间接的影响；二是转基因作物对大自然生态平衡的破坏；三是相关的伦理道德问题。由于转基因生物及其产品的潜在风险，其管理受到各国政府的高度重视。转基因食品的标签是目前争议最大的问题。世界卫生组织在20世纪90年代提出了对转基因食品进行安全性评价的要求。2000年1月28日，国际社会在相互妥协的基础上，就生物安全的一些重要问题，尤其是转基因技术及其产品的越境转移等问题达成了共识，在加拿大蒙特利尔通过了《卡特基娜生物安全议定书》。联合国粮农组织和世界卫生组织所属的国际食品规定委员会正在准备制订转基因食品的国际安全标准，世界其他国家和地区也纷纷制订了相关法律或法规。由于各国对彼此间的转基因食品及食品原料贸易有所限制，另外国外一些食品公司已放弃转基因食品原料不用，转而采用非转基因原料。为保护广大消费者的权益，满足其选择权、知情权以及出于国际贸易的需要，转基因食品的检测越来越引起各国政府和有关食品监督机构的重视。但是由于基因重组技术的复杂性和多样性，给转基因食品的检测带来了很大的困难，因此建立国际间标准的快速、准确的检测方法，已成为各国政府和研究者亟待解决的问题。从转基因技术建立之日起，转基因技术亦随之建立，因为在基因重组的技术中，离不开重组基因的检测和筛选。这些方法的针对性很强，有的仅对某个转基因生物的构建有效，却为转基因检测技术的建立打下了基础。目前主要有两类转基因检测方法基于特异性DNA片断的PCR(polymerase ChainReaction)检测技术和基于特异性蛋白的ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assays)检测方法。前者特异性DNA片断包括外源启动子、终止子、报告基因和目的基因。后者特异性蛋白主要是外源目的蛋白和一些报告基因所表达的蛋白。两种方法的出发点不同，各有优缺点。一般来说，PCR法可将食品中残存的DNA增幅到100万倍以上，检出灵敏度高，但操作不当易产生假阳性现象。ELISA法不适用于经高温加工的食品，因为加热会使蛋白变性而无法检测。1996年德国伯恩斯坦大学的Meyer Rolf等论证了PCR检测转基因食品的可能性。到目前为止，全世界已有30多种转基因产品得到相关国家的安全评价，在现有的商品化转基因产品中绝大多数含CaMV 35S启动子和NOS终止子，两种因子常用于转基因植物的构建，这就为人们建立针对这两种成分的转基因阳筛选检测方法提供了便利。最近一些国外实验室已将报告基因GUS、NPE II基因，目的基因CRY、CPT等作为检测目标，力争更准确可靠检出转基因成分。由于PCR技术要求比较严格，高灵敏性以及实验室的遗留污染，在日常的转基因食品检测中常出现假阳性结果。目前在转基因食品检测中主要是以35S CaMV启动子和NOS终止子作为检测目标，来判定食品中是否含有转基因成分。定性筛选PCR本身具有局限性，所采取的PCR法因其高敏感性常伴有假阳性现象，而操作上的误差，加上一些反应抑制因素亦可带来假阴性现象，其最大的不足是无法对转基因成分进行定量分析。为此，研究者们在定性筛选PCR方法的基础上，发展了不同的定量PCR检测方法。目前，国外较为成熟的方法主要有定量竞争PCR(Quantitativecompetitive，QC-PCR)和Real-time PCR法。现在世界上一些实验室正致力于基因芯片的研究，这是转基因检测技术的一个很有前景的发展方向。基因芯片技术的原理是根据分子生物学中成熟的核酸分子原位杂交技术，即DNA的碱基配对和序列互补原则，特大量探针分子固定于约1cm2大小的芯片上，然后与标记的样品杂交，通过检测杂交信号的强弱判定样品中靶分子的数量。此技术可以对大量DNA或RNA分子进行检测分析，大大提高检测效率和精确性。总之，转基因食品检测技术的发展趋势应是操作简便、费用较低、普适性强。对现有或新出现的转基因食品都能快速方便准确地检测。总而言之，转基因生物的安全性必须建立在转基因成分检测的结果上。目前世界上常用的转基因检测方法主要有两种一是检测有无来自其他生物成分即以外源结构基因表达出蛋白质为目的的蛋白质检测方法；另一种是检测非转基因植物所不拥有的启动子、终止子、标记基因的DNA检测方法。由于蛋白质检测方法对含量低及深加工的转基因产品无法检测，故DNA检测方法应用范围相对要广。当今，国内外对采用转基因产品为原料，经深加工或精加工的食品即使采用DNA检测方法，也无法检出转基因成分。例如酱油、色拉油的制成要经过发酵、加热和分离等工序，导入的外源DNA及其产生的蛋白质已经分解。所以迄今为止还无有效的检测方法来判断是否含转基因成分，这在国际生物界是一个公认的难题。由于转基因产品越来越多地成为食品的原材料，如大豆、玉米等，因此对进口原材料和食品进行转基因检测成为转基因生物安全性检测的突出问题。若能够从被检样品中提取高质量的适于PCR模板的痕迹量DNA，特别从那些深加工或精加工的食品(酱油、色拉油、豆奶、番茄酱、饼干等)中提取痕迹量的高质量的DNA，仍是转基因安全性检测的棘手问题。鉴于此，本专利技术建立了一种从酱油、豆奶、番茄酱中分离残留DNA的方法，在常规DNA提取技术的基础上，增加了Sephadex-G 50柱分离及Chelex溶液热处理两个步骤，不仅能有效去除酱油、豆奶、番茄酱中的小分子发酵产物、多糖、防腐剂、固定剂、明矾及色素等物质，而且能够获得高质量的可用于检测的痕迹量DNA，该方法简单且有效、成本低、灵敏度和检出率高，所获得的痕迹量DNA可用于定性和定量PCR扩增。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种从酱油、豆奶、番茄酱中分离残留DNA的方法。方法的步骤为1)取50ml的酱油、豆奶、番茄酱，12,000rpm离心15-20min，弃上清，保留沉淀；2)取0.5ml溴代十六烷基三甲铵提取缓冲液溶解沉淀，溴代十六烷基三甲铵提取缓冲液为2％溴代十六烷基三甲铵，50mmol/L Tris碱，pH8.0，10mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0，0.8mol/L氯化钠；3)65℃保温30～90min，其间不时轻缓颠倒混匀；加入0.5ml 1∶1的苯酚/氯仿，混匀至乳浊状，12,000rpm离心10-15min至分相，吸取上清液用Sephadex-G50柱离心过柱；4)加入等体积的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇于-70℃或-20℃放置1-2小时，12,000rpm离心10-15min，弃上清，保留沉淀；5)70％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心10-15min，重复洗涤沉淀1-2次，室温干燥后，向沉淀中加入200μl 1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从酱油、豆奶、番茄酱中分离残留ＤＮＡ的方法。其特征在于，方法的步骤为：１）取５０ｍｌ的酱油、豆奶、番茄酱，１２，０００ｒｐｍ离心１５－２０ｍｉｎ，弃上清，保留沉淀；２）取０．５ｍｌ溴代十六烷基三甲铵提取缓冲液溶解沉淀，溴 代十六烷基三甲铵提取缓冲液为２％溴代十六烷基三甲铵，５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ碱，ｐＨ８．０，１０ｍｍｏｌ／Ｌ乙二胺四乙酸，ｐＨ８．０，０．８ｍｏｌ／Ｌ氯化钠；３）６５℃保温３０～９０ｍｉｎ，其间不时轻缓颠倒混匀；加入０．５ｍｌ１ ∶１的苯酚／氯仿，混匀至乳浊状，１２，０００ｒｐｍ离心１０－１５ｍｉｎ至分相，吸取上清液用Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ５０柱离心过柱；４）加入等体积的异丙醇或２．５倍体积的无水乙醇于－７０℃或－２０℃放置１－２小时，１２，０００ｒｐｍ离心１ ０－１５ｍｉｎ，弃上清，保留沉淀；５）７０％乙醇洗涤沉淀，１２，０００ｒｐｍ离心１０－１５ｍｉｎ，重复洗涤沉淀１－２次，室温干燥后，向沉淀中加入２００μｌ１０％的Ｃｈｅｌｅｘ溶液，充分混匀，１００℃煮５－１０ｍｉｎ；６）１２ ，０００ｒｐｍ离心后，其上清可直接用于聚合酶链式反应的模板。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：董海涛，李德葆，姜玉新，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]