从大豆异黄酮中快速分离残留DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种从大豆异黄酮中快速分离残留ＤＮＡ的方法。方法的步骤为：取０．１ｇ大豆异黄酮粉末，加入２００μ　　１１０％的Ｃｈｅｌｅｘ溶液，充分混匀，１００℃煮５－１０ｍｉｎ；１２，０００ｒｐｍ离心１０－１５ｍｉｎ，吸取上清液，Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ２５柱离心过柱后的溶液直接用于聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增。与常规ＤＮＡ提取方法相比，该方法可快速从大豆异黄酮中分离残留ＤＮＡ，该技术流程可有效去除所得ＤＮＡ中抑制ＰＣＲ反应的抑制因子，可用于聚合酶链式反应的模板。该方法简单、快速、成本低、灵敏度和检出率高，所获得的痕迹量ＤＮＡ可用于定性和定量ＰＣＲ扩增。该技术流程适用于转基因农产品的多聚酶链式反应检验及相关领域，也可用于大豆异黄酮提取工艺的质控和优化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术为生物
，尤其涉及一种从大豆异黄酮中快速分离残留DNA的方法。
技术介绍
1986年，美国科学家发现大豆中抑制癌细胞的异黄酮。异黄酮在自然界中的分布只局限于豆科的蝶形花亚科等极少数植物中，如大豆、墨西哥小白豆、苜蓿和绿豆等植物中，其中异黄酮含量最高的只有苜蓿和大豆，一般苜蓿中异黄酮的含量为0.5％-3.5％，大豆中异黄酮含量为0.1％-0.5％。大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次生代谢产物，是生物黄酮中的一种，也是一种植物雌激素。它主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中，种皮中含量极少。80％-90％的异黄酮存在于子叶中，浓度为0.1％-0.3％。胚轴中所含异黄酮种类较多且浓度较高，为1％-2％，但由于胚只占种子总重量的2％，因此尽管浓度很高，所占比例却很少(10％-20％)。目前已明确大豆异黄酮抗癌的主要作用机制，包括以下几个方面类似女性雌激素作用以及抗激素作用；抑制与癌相关酶活性的作用，特别是酪蛋酸激酶；在癌细胞增殖的促进阶段，具有抑制血管增生作用；消除活性氧，从而具有抗氧化作用；调节细胞周期；此外，还确认染料木黄酮具有抑制一些与DNA切断有关酶活性的作用等。从大豆中获取异黄酮在技术上并不复杂，将大豆粉碎脱脂后就可用酒精萃取和纯化。我国的豆制品主要是豆腐，传统生产豆腐时水溶性的异黄酮大量从废水中排出。现在，科技人员设计了从豆腐黄浆水中回收异黄酮的工艺。直接将豆腐黄浆水的水分蒸发掉就可用于纯化，但消耗能量很多。作为工业生产以吸附沉淀为宜，建议采用活性氧化铝等吸附能力强的吸附剂，然后再用酒精萃取和纯化。这也可作为解决豆制品厂环境污染的综合措施之一。各种大豆制品中异黄酮含量和种类分布不同，不仅与大豆品种和栽培环境有关，还与大豆制品的加工工艺密切相关。水处理、热处理、凝固、发酵等加工环节和方法显著地影响了大豆制品中异黄酮的含量和种类分布，特别是大豆浓缩蛋白和大豆分离蛋白的不同提取方法其中异黄酮含量影响极大。随着人们对大豆异黄酮的生理功能的认识以及对大豆的大量需求，使我国每年进口大量的大豆和大豆异黄酮产品。然而，世界上主要大豆生产国美国和巴西所生产的大豆及其相应的产品多为转基因农产品，这就涉及到转基因生物安全性检测问题。虽然大豆异黄酮的提取过程简单，但水处理、热处理、凝固、发酵、脱脂、萃取和纯化等加工环节都显著影响从大豆异黄酮产品中有效地提取痕迹量DNA，并进行随后的转基因生物安全性检测。鉴于此，本专利技术建立了一种从商品化的大豆异黄酮中快速分离残留DNA的方法，Chelex溶液热处理及Sephadex-G 25柱分离两个步骤，不仅能有效地从高浓度大豆异黄酮中分离出痕迹量DNA、而且能够去除混杂的小分子发酵产物以及其它的次生代谢物质，最终获得可用于PCR等分子检测手段的较高质量的DNA，该方法简单且有效、成本低、灵敏度和检出率高，所获得的痕迹量DNA可用于定性和定量PCR扩增。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种从商品化的大豆异黄酮中快速分离残留DNA的方法。方法的步骤为1)取0.1g大豆异黄酮粉末，加入200μl 10％的Chelex溶液，充分混匀，100℃煮5-10分钟；2)12,000rpm离心10-15min，吸取上清液，3)Sephadex-G 25柱离心过柱后的溶液直接用于聚合酶链式反应(PCR)扩增。本专利技术的优点是1)与常规DNA提取技术相比较，该方法能快速从大豆异黄酮中提取痕迹量DNA，大大缩短了DNA提取时间。2)运用Sephadex-G 25柱分离能有效去除所得DNA中的可能抑制PCR反应的抑制因子，从而获得可用于PCR等分子检测手段的痕迹量DNA；3)该方法简单有效、成本低，其灵敏度和检出率高于常规DNA提取方法。附图说明图1.lectin基因PCR扩增结果，图中M为分子量标记，1为大豆阳性对照，2为试剂盒抽提DNA的PCR扩增产物，3为CTAB法抽提DNA的PCR扩增产物，4为Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR扩增产物，5为本专利技术的方法抽提DNA的PCR扩增产物，6为阴性对照；图2.35S-CTP基因PCR扩增结果，图中M为分子量标记，1为大豆阳性对照，2为试剂盒抽提DNA的PCR扩增产物，3为CTAB法抽提DNA的PCR扩增产物，4为Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR扩增产物，5为本专利技术的方法抽提DNA的PCR扩增产物，6为阴性对照；图3.Cp4-epsps基因PCR扩增结果，图中M为分子量标记，1为大豆阳性对照，2为试剂盒抽提DNA的PCR扩增产物，3为CTAB法抽提DNA的PCR扩增产物，4为Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR扩增产物，5为本专利技术的方法抽提DNA的PCR扩增产物，6为阴性对照；图4.Nos终止子基因PCR扩增结果，图中M为分子量标记，1为大豆阳性对照，2为试剂盒抽提DNA的PCR扩增产物，3为CTAB法抽提DNA的PCR扩增产物，4为Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR扩增产物，5为本专利技术的方法抽提DNA的PCR扩增产物，6为阴性对照；图5.CaMV35S启动子基因PCR扩增结果，图中M为分子量标记，1为大豆阳性对照，2为试剂盒抽提DNA的PCR扩增产物，3为CTAB法抽提DNA的PCR扩增产物，4为Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR扩增产物，5为本专利技术的方法抽提DNA的PCR扩增产物，6为阴性对照。具体实施例方式实施例1. 本实施例中所用的试剂除氯仿、乙醇、异戊醇、异丙醇为国产试剂外，其余试剂均为promega产品。(一)CTAB法抽提残留DNA取0.1g大豆异黄酮粉末。将粉末状的干物质加入400μl预冷的CTAB提取缓冲液(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，700mmol/L NaCl，pH8.0)中。加入500μl 65℃预热的CTAB提取缓冲液II(2％CTAB，50mmol/L Tris-Cl，10mmol/LEDTA，800mmol/L NaCl，pH8.0)，1μl 2-巯基乙醇，混匀，65℃保温30-90分钟，其间不时轻缓颠倒混匀。待冷至室温后加入450μl氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀至溶液呈乳浊状。12000rpm离心2min至分相。将上清液转移至干净的离心管中，加入5μl Rnase A储液，室温下保温30min。依次加入600μl异丙醇及60μl乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀。12,000rpm离心10min，沉淀DNA。弃上清液后，加入800μl 76％乙醇，12,000rpm离心10min，弃上清液后，再加入100μl 70％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心5min，沉淀DNA，除去残留的乙醇。DNA沉淀溶解于100μl TE缓冲液中，4℃保存备用。(二)Chelex直接煮沸法取0.1g大豆异黄酮粉末。取200μl 10％的Chelex溶液溶解沉淀；振荡数分钟，使沉淀充分溶解于Chelex溶液中，100℃煮5～10min，12,000rpm离心5min，上清液即可用于PCR。(三)试剂盒法抽提残留DNA取0.1g大豆异黄酮粉末。加入25ml正己烷，充分混合后2小时后，加入2.5ml BufferA后，再65℃水浴中加热，并不断混合，2小时后以12,000rpm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从大豆异黄酮中快速分离残留ＤＮＡ的方法。其特征在于，方法的步骤为：１）取０．１ｇ大豆异黄酮粉末，加入２００μｌ１０％的Ｃｈｅｌｅｘ溶液，充分混匀，１００℃煮５－１０分钟；２）１２，０００ｒｐｍ离心１０－１５ｍｉｎ，吸 取上清液，３）Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ２５柱离心过柱后的溶液直接用于聚合酶链式反应扩增。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李德葆，董海涛，戴承恩，娄沂春，姜玉新，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]